林 霄，孙国平，章 菊,2，刘加涛

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，晚期肝癌病死率位列第三，5年生存率仅为14%[1]。内科治疗是肝癌患者的主要选择，但治疗效果并不理想。近年来中药天然产物因其温和的副作用和优良的治疗效果受到许多关注[2]，研究[3-4]表明槐耳清膏在乳腺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中均能起到有效的抗肿瘤作用。此外，无论是单独使用还是联合用药，槐耳清膏都表现出较低的细胞毒性[5]。许多药物在治疗肿瘤的同时能够引发肿瘤细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，而ERS是导致恶性肿瘤耐药的主要原因[6]，但槐耳清膏能否诱导肝癌细胞产生ERS尚不明确。该文首先探讨槐耳清膏在治疗肝癌的同时能否引发肝癌细胞ERS，再与ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)联合使用，探究抑制ERS能否增强槐耳清膏的抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料来源肝癌细胞株Hep3B和HepG2购自中国科学院细胞库。细胞系经STR鉴定，用qPCR分析细胞内无支原体。以高糖DMEM(美国Hyclone公司)加入10%胎牛血清(澳大利亚Clark公司)和青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 mg/ml)配置成细胞培养液。细胞培养于37 ℃、5%CO2加湿的培养箱中。

1.2 主要试剂槐耳清膏(启东盖天利医药有限公司)用DMEM充分溶解，稀释成10 mg/ml，用0.22 μm滤膜过滤2次，保存在-80 ℃冰箱中。MTT检测试剂盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(上海贝博生物科技公司)，4-PBA(P21005，美国Sigma公司)，PMSF蛋白酶抑制剂、RIPA细胞裂解缓冲液(上海碧云天生物技术公司)，Bax(ab32503)、CHOP(ab11119)和GRP78(ab21685)一抗(英国Abcam公司)，PERK(BS2156)和Bcl-2(BS3171)一抗(美国Bioworld Technology Inc公司)，IRE1(#3294)一抗(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.3 MTT法测定细胞活力肝癌细胞(5 000个/孔)接种在96孔板中培养过夜，与不同浓度(0、2、4、6、8 mg/ml)的槐耳清膏共同孵育。……