乔鲁卉 张云涛 杨忠学 马子雨 侯玉东

1 滨州医学院口腔医学院 山东 烟台 264003；2 滨州医学院附属医院口腔修复科 山东 滨州 256603

随着口腔种植技术的日益更新，其适应范围逐渐扩大，种植区域骨缺损的问题随之增加。骨组织工程为骨缺损修复提供了新的途径，作为其组成部分的支架材料可以为种子细胞的增殖和分化提供物理、化学和生物支持[1]。人工合成高分子材料聚己内酯(polycaprolactone，PCL)具有良好的机械性能和可控的降解速率[2]，富含纳米羟基磷灰石能够增加材料的骨传导性，已被证实可以作为组织工程的支架材料[3]。以往研究表明纳米羟基磷灰石与聚己内酯(nano-hydroxyapatite/polycaprolactone，nHA/PCL)复合纤维支架能够促进成骨细胞的粘附、增殖与分化[4]。

HU-308能够与人源二型大麻素受体(Cannabinoid receptor subtype 2,CB2受体)特异性结合，以促进成骨过程。体外研究表明HU-308能够刺激新生小鼠颅骨成骨细胞和MC3T3-E1成骨细胞的增殖，同时伴有碱性磷酸酶活性增强和细胞外矿化物质的积累[5-6]。目前国内外虽对HU-308作用于成骨细胞生物学性能影响的研究较多[7-8]。但以电纺丝膜为载体，研究HU-308对成骨细胞增殖分化影响的报道较少。本研究制备含不同浓度HU-308的nHA/PCL电纺丝膜，观察HU-308与nHA/PCL电纺丝膜对成骨细胞生物学性能的影响，以期为日后修复骨缺损提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与材料 CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)，激光扫描共聚焦显微镜(TCS SPE，Leica，德国)，扫描电子显微镜(ZEISS EVOLS15，德国)，荧光实时定量 PCR仪(Rotor-Gene 3000，Corbett，澳大利亚)，酶标仪(SpectraMax M2，MolecuLar Devices，美国)，78-1型磁力加热搅拌器(格莱莫，武汉)，恒温磁力搅拌器(中大仪器，江苏)，微量注射泵(康康医疗，安徽)。

聚己内酯(Sigma，美国)，纳米羟基磷灰石(麦克林，上海)，三氯甲烷(国药试剂)，N,N-二甲基甲酰胺(国药试剂)；反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)，实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix ExTaqTM，Takara，日本)，CCK-8检测试剂盒(日本同仁)，HU-308(Cayman)；碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天)，总RNA 提取试剂(RNAiso Plus)，罗丹明-鬼笔环肽(Rhodamine Phalloidin，Cytoskeleton，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 MC3T3-E1细胞培养 使用α-MEM 完全培养基(10% FBS，青霉素 100 U/mL，链霉素100 μg/mL)在无菌条件下培养MC3T3-E1成骨细胞，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换液，3 次传代后取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 HU-308培养液的配制 分别配制含有浓度为0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L HU-308的完全培养基。

1.2.3 nHA/PCL电纺丝膜的制备 室温下将2.4 g PCL溶解于5 mL DMF及7.5 mL DCM的混合溶液中，然后按照40%(wt/wt)比例加入纳米羟基磷灰石，然后磁力搅拌至少8 h至完全混合均匀。高压电压为25 kV，微量注射泵控制静电纺丝溶液流速在3 mL/h，接收板到针尖的距离为20 cm。所有制备的静电纺丝成膜后，收集于室温下置于真空干燥箱干燥备用。

1.2.4 扫描电子显微镜制件的制作 各组静电纺丝用铝箔纸接收后，干燥备用。将膜剪成4.5 mm×4.5 mm大小，将其用导电胶固定于金属载物台，表面喷金处理后，置于扫描电子显微镜(ZEISS EVOLS15，德国)下观察并拍照，电子加速电压为20 kV。

1.2.5 细胞接种 用打孔器将静电纺丝膜制成各种直径的圆形薄膜，用紫外线灯正反面照射2 h，将薄膜置于细胞培养板中，用自制等大的无菌不锈钢环将薄膜固定于培养板底部。每孔加入含有1%青霉素-链霉素的PBS浸泡2 h后，吸净PBS并接种细胞，待细胞贴壁，更换为含不同浓度HU-308的完全培养基培养细胞。

1.2.6 CCK-8检测细胞增殖情况 将电纺丝膜处理后置于96孔细胞培养板中，每组设置3个复孔，每孔接种2×103个细胞，培养箱中培养24 h，分别更换为含HU-308 0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L培养液。培养1、4、7 d后，更换含10 μL CCK-8液的完全培养基，置于恒温培养箱内培养2 h。反应完成后，将上清液转移至空白细胞培养板中，用酶标仪检测450 nm波长的OD值。

1.2.7 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性检测 将电纺丝膜处理后置于24孔板内，每孔接种1×105个细胞。每孔1 mL，每组设3个复孔，培养箱中培养24 h。细胞贴壁后，分别替换为含不同浓度HU-308 0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的钙化诱导液。培养1、4、7 d，按照ALP说明书将细胞充分裂解后离心取上清，测定405 nm波长的OD值。

1.2.8 实时定量反转录聚合酶链反应(Real Time-PCR)检测骨保护蛋白(osteoprotegerin，opg) mRNA表达 将细胞重悬接种，成骨诱导7 d。按照试剂盒RNAiso Plus提取总RNA，分光光度计检测其纯度，保证各组纯度比值均介于1.8～2.2(高纯度)并逆转录 cDNA。内参磷酸甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，gapdh)及目的基因opg的引物由上海生工生物公司合成，引物设计见表1。选择20 μL体系(SYBR II 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，Real Time-PCR反应液1.6 μL，焦碳酸二乙酯水6.8 μL)进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性30 s，1个循环；95℃变性5 s，60℃退火30 s，45个循环。

表1 opg和gapdh 引物序列

1.2.9 激光共聚焦显微镜观察细胞伸展、粘附 将电纺丝膜处理后置于24孔板底部，细胞以1×105密度接种，每孔1 mL， 24 h贴壁后更换培养液为不同浓度HU-308 0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L培养液，每组3个复孔，培养箱培育24 h。室温下透膜处理5 min，磷酸盐缓冲液浸洗；每孔加入200 μL 5μg/mL的TRITC Phalloidin避光孵育30 min，PBS清洗3次，吸去多余的水分，将支架与细胞用含有DAPI的水溶性的甘油封片，激光共聚焦显微镜观察并拍照。

2 结果

2.1 nHA/PCL电纺丝膜电子显微镜观察 电纺丝膜呈随机纵横交错的三维网状立体结构，表面有因富含nHA形成的突起，略粗糙，该结构有利于细胞的黏附与铺展，见图1。

2.2 CCK-8检测细胞增殖情况 培育1、4、7 d后，与对照组相比，各实验组间细胞增殖活性增强，P<0.05；随着培育时间的延长，同一实验组细胞增殖活性逐渐增强，P<0.05，见图2。这说明，药物浓度增加可明显促进细胞增殖。

2.3 ALP活性的比较 随着培育时间的延长，同一实验组MC3T3-E1细胞中的ALP活性增加，P<0.05；培育1、4、7 d后，相同时间点对照组与各实验组OD值比较，差异无统计学意义，见图3。

2.4 OPG mRNA表达情况的比较 在相同时间点，与对照组比较，低浓度HU-308(10-10mol/L、10-9mol/L)促进OPG mRNA的表达，P<0.05 ；高浓度HU-308对OPG mRNA的表达起抑制作用，且浓度越高抑制作用越明显，P<0.05，见表2。

表2 不同浓度HU-308和nHA/PCL电纺丝膜对opg mRNA 表达的影响

2.5 细胞骨架的形态的比较 细胞骨架交织呈网状，对照组细胞形态较缩窄，细胞伸展较好，随着实验组浓度增加，细胞体积以及铺展范围逐渐增加。与对照组相比，实验组可见细胞黏附的数量增多，且细胞形态更伸展，随HU-308浓度增加变化更明显。其中10-6mol/L组中，细胞伸展范围最广，细胞骨架最为清晰，见图4。

3 讨论

随着口腔种植技术的迅速发展，人们对种植区域骨缺损修复问题的关注逐渐增多。大多数骨替代材料发挥作用的原理是利用有机相在矿化组织的结构模板中的作用，模仿生物矿化的过程[9]。聚己内酯复合纳米羟基磷灰石纤维支架材料因具有良好的生物相容性、接近天然骨基质的成分和结构特征而成为骨替代材料的研究热点[10]。

在骨缺损修复的药物应用方面，近来研究表明含HU-308药物涂层的种植体对骨质疏松大鼠骨缺损部位成骨细胞的增殖分化和初期骨结合的促进作用明显[11]。基于此，本研究进一步探索由静电纺丝制备的nHA/PCL复合纤维支架与HU-308联合使用对成骨细胞的作用效果。

在本实验中，不同浓度的HU-308都能促进nHA/PCL电纺丝薄膜上MC3T3-E1的短期增殖，其中以10-6mol/L浓度HU-308和nHA/PCL电纺丝薄膜组促进成骨细胞增殖作用最强。这与Ofek等[12]关于HU-308浓度呈剂量依赖性增加内皮成骨细胞的数量和活性的研究结果基本一致，与裴方等[13]关于HU-308对钛颗粒抑制成骨细胞活性的逆转作用相符。存在少量差异可能与支架材料对细胞黏附的促进作用以及细胞种类有关。

OPG是重要的成骨相关因子，在OPG/RANKL/RANK 系统中通过抑制RANKL/RANK信号通路，抑制破骨细胞的增殖分化。抑制骨吸收的药物能显著上调成骨细胞中OPG mRNA的表达[14]。李友瑞等[15]探讨了电纺支架材料对前体成骨细胞成骨相关基因表达的促进作用，提示适宜的复合支架有利于成骨诱导。在本实验中，当使用含HU-308的培养液进行成骨诱导并与电纺支架共培养后，促进OPGmRNA表达上调的最适宜浓度为10-10～10-9mol/L，在高浓度HU-308作用下OPG mRNA的表达出现抑制。这与张宇[16]等探究高糖环境下HU-308对成骨细胞作用研究中的促进作用浓度是一致的，提示nHA/PCL电纺丝薄膜的联合使用对药物的作用无抑制作用，且低浓度HU-308可促进电纺丝薄膜上MC3T3-E1的成骨分化，从而促进新骨形成，有利于种植体的稳定。

成骨细胞的细胞骨架主要是肌动蛋白，能够维持细胞形态，调控细胞的附着、增殖[17]。在本实验中观察到随着HU-308浓度的增加，细胞体积与细胞伸展范围增大，提示其促进了细胞在支架材料上的粘附。

综上所述，HU-308与nHA/PCL电纺丝膜存在协同促进MC3T3-E1成骨细胞的粘附、增殖的能力。这为进一步使用HU-308作为骨缺损修复支架材料的辅助药物，以促进种植区域骨再生提供一定的理论依据。