张莉华，陈少军

（1 浙江医药高等专科学校食品学院 浙江宁波315000 2 浙江医药高等专科学校中药学院 浙江宁波315000）

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）肺炎（新冠肺炎）于2019年12月以来在国内外爆发、蔓延，已成为全球高度关注的突发公共卫生事件[1-4]。世界卫生组织于2020年2月12日宣布，将新冠肺炎命名为COVID-19 （Corona Virus Disease 2019）[5]。COVID-19 被证实为是一种急性呼吸道传染病，具有潜伏期长、传染性强和人群普遍易感的特点[2，6-7]。COVID-19 的防治是当前面临的紧急问题。通过一系列预防控制和医疗救治措施，我国境内疫情得到抑制和缓解，而境外的发病人数呈上升趋势[4]。在没有特效药的情况下，中医药在预防和治疗COVID-19 全过程中都发挥着重要作用[8]。

药食同源的生姜是防治过程中常用到的一味药。对国家和各省市、国医大师、院士和知名中医临床专家发布的众多中药预防方案进行研究发现，黄芪、金银花和生姜在预防用药中值得予以关注[9]。预防方案中的足浴方是以花椒和生姜等辛香之品为主[10]。对《瘟疫论》、《广瘟疫论》中治疗瘟疫用药规律分析，单味药甘草、生姜和芍药使用频率最高[11]。在抗新型冠状病毒基于花生四烯酸代谢通路防治“细胞因子风暴”的研究中，发现中药厚朴、生姜、金银花、大黄等对花生四烯酸代谢通路具有抑制成分[12]。同时，从中药化学成分数据库中筛选并发现生姜等中药对SARS-CoV-2 病毒的3CL 水解酶有药理活性作用[13]。从国家及各省市公布的中医药抗SARS 和新型冠状病毒方案中筛选出46 个能作用于新型冠状病毒S 蛋白与人体ACE2 结合区域且具有较高结合能的中草药活性成分，它们主要归属于桑叶、苍术、浙贝母、生姜、金银花、连翘、草果等7 味中药[14]。综上，生姜具有潜在的COVID-19 防治作用。

生姜自古以来就是药食两用佳品，具有解表散寒、温中止呕、温肺止咳和解毒功效。虽然它现在广泛用于防治COVID-19，但其预防机理仍未清楚。本文以生姜活性成分6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚（三者均是药典含量测定指标成分）为研究对象，采用化学相似性搜索方法预测其作用靶点；采用人工数据挖掘病毒性肺炎的疾病靶点，由交集获得生姜活性成分作用于病毒性肺炎的靶点，然后进行基因本体富集和通路富集分析，并构建 “成分-靶点-通路” 网络，为了解生姜防治COVID-19 作用机理提供依据，也为饮食调理提供参考。

1 材料与方法

1.1 活性成分作用靶点的预测

药物靶点的确认是药物开发研究的核心步骤之一。SwissTargetPrediction 是以小分子化学结构二维/三维结构相似性原理来预测潜在靶点[15]。它包含有37 634 个小分子成分的化学库和有3 068个靶点的大分子蛋白库[15]。首先在Pubchem database 检索并将6-姜辣素（Pubchem CID：442793）、8-姜酚（Pubchem CID：168114）和10-姜酚（Pubchem CID：168115）的 Canoncial SMILES 结构分别导入到SwissTargetPrediction 服务器。获得靶蛋白数据人工审核后做Venn 集合分析。取预测出来的靶蛋白做方法学验证。

1.2 病毒性肺炎相关疾病靶点收集

病毒性肺炎相关疾病蛋白分别从The Comparative Toxicogenomics 数据库（http：//ctdbase.org/，CTD database）和 GeneCards （https：//www.genecards.org/）数据库中以“viral pneumonia”为关键词进行查询并人工校对，然后用String 11.0 对疾病相关蛋白相互作用进行分析。

1.3 生姜活性成分预防病毒性肺炎靶点

对第1 步骤获得的SwissTargetPrediction 预测的靶点集合和第2 步骤获得病毒性肺炎疾病相关蛋白集合交集分析并Venn 作图。交集的靶蛋白可能是生姜防治COVID-19 的潜在作用靶蛋白，并用GeneMANIA 分析。

1.4 富集分析和网络构建

将上一步骤的交集靶蛋白信息分别导入到Omicshare 平台和DAVID 数据库进行GO 富集分析和KEGG 通路注释，并用Cytoscape 3.3 软件构建了“成分-靶点-通路”网络作用图。

2 结果

2.1 生姜活性成分作用靶点的预测结果

SwissTargetPrediction 预测结果经人工审核校对后，6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的预测靶点分别是107，105 和106 个。这些靶蛋白主要分布在激酶（kinase），核受体（nuclear receptor）和A 类G 蛋白偶联受体（Fmaily A G protein-coupled receptor）中（图1a，b，c）。因6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚化学结构高度相似，如Venn 图所示，生姜3 个活性成分共涉及到168 个靶蛋白，其中三者都作用的靶蛋白有51 个（图1d）。表1中列出前15 位的靶蛋白，其中HTR1A，ALOX5 和HSD11B1分别排在前3 位。

图1 活性成分的预测靶蛋白分布饼图Fig.1 Pie chart of predicted targets for active compounds

表1 SwissTargetPrediction 预测的前15 位潜在生姜活性成分作用靶点Table 1 The potential top 15 targets of active compounds from ginger by SwissTargetPrediction

在DrugBank 数据库中分别查到小分子药物丁螺环酮（Buspirone），齐留通（Ziltuton）和甲泼尼龙 （Methylprednisolone）可分别作用于HTR1A，ALOX5 和HSD11B1 蛋白。将这3 个小分子药物的SMILE 化学结构上传到SwissTargetPrediction进行预测，可发现目标蛋白在预测结果中分别排第4 位，第1 位和第13 位（表2），说明SwissTargetPrediction 方法学具有较高的准确性。

2.2 病毒性肺炎疾病靶蛋白相互作用

以“viral pneumonia”为关键词，从CTD 数据库中检索并审核得到34 个病毒性肺炎疾病相关蛋白集。同样从GeneCard 数据库中检索到4 078个原始数据，为提高准确度和减少工作量，本研究以相关性得分＞15 筛选并删掉重复值等，确定239个疾病相关蛋白集。这2 个蛋白集合并，最终获得253 个与病毒性肺炎疾病相关的蛋白。这253 个构成了一个非常复杂的蛋白相互作用网络 （图2）。表3列有其涉及到的前10 种生物过程，均与免疫系统调节和细胞因子反应等密切相关。

表2 用于方法学验证的3 个对照药SwissTargetPrediction 预测结果Table 2 The SwissTargetPrediction results of three control drugs for methodology validation

图2 String 2.0 做出的253 个病毒性肺炎相关蛋白的相互作用网络Fig.2 The protein-protein interactions network of 253 viral pneumonia-related targets using String 2.0

表3 String 2.0 计算出的前10 位病毒性肺炎相关疾病蛋白的生物过程Table 3 The top 10 biological process of viral pneumonia-related targets using String 2.0

2.3 生姜活性成分防治病毒性肺炎的靶点确认

将试验第1 步骤获得生姜活性成分的SwissTargetPrediction 预测靶蛋白集与第2 步骤获得2个病毒性肺炎相关蛋白集进行交集发现，3 个集合共同交集于数目为3 的集合，且SwissTargetPrediction 与GeneCard 还交集于数目15 的集合 （图3a）。这样获得了生姜活性成分作用于病毒性肺炎疾病密切相关的18 个靶蛋白（表4）。采用Gene-MANIA 分析发现，这18 个兴趣蛋白相互作用最主要的方式是物理相互作用 （physical interactions），占42.62%（图3b），说明这些蛋白在功能上具有一定的相似性。

图3 18 个生姜活性成分作用病毒性肺炎的潜在靶点Fig.3 The 18 target of active compounds of ginger for viral pneumonia

表4 生姜活性成分作用于病毒性肺炎的18 个潜在靶蛋白Table 4 Potential 18 targets for active compounds of ginger related to viral pneumonia

2.4 富集分析和网络构建

将这18 个重要靶蛋白分别输入到Omicshare进行GO 富集分析，排前5 的生物过程分别是：白细胞分化（leukocyte differentiation）、肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）、肽基酪氨酸修饰（peptidyl-tyrosine modification）、细胞活化 （cell activation）和细胞表面受体信号通路（cell surface receptor signaling pathway）（图5）。

将这18 个重要靶蛋白分别输入到DAVID 进行KEGG 富集分析，共获得21 条靶标富集的疾病通路（P＜0.05，false discovery rates，FDR＜0.05）。前3 位分别是非小细胞肺癌通路 （Non-small cell lung cancer）、癌症通路（Pathways in cancer）和病毒致癌通路（Viral carcinogenesis）（表5）。最后，采用Cytoscape 软件构建生姜的 “3 个活性成分-18个靶点-21 条通路”作用网络，初步阐释了生姜多成分、多靶点和多通路防治COVID-19 的机理研究。

图4 核心靶蛋白的前20 位基因本体生物过程富集信息Fig.4 The top 20 GO biological process （BP）of 18 key targets

表5 生姜活性成分作用的病毒性肺炎相关靶点富集的KEGG 通路Table 5 KEGG pathways of viral pneumonia-related targets for active compounds of ginger

3 讨论

COVID-19 属于中医疫病，病位在肺，基本病机特点为“湿、热、毒、瘀”，常见病机是邪毒犯肺，挟热下利，肺失宣降，水停生湿[16-17]。因此，在防治方案中，辛味和苦味药物配伍使用最多，采用了辛开苦降的治疗大法[18]。作为药食同源的代表药，生姜归肺经，辛温发散，能温肺散寒、化痰止咳，能对肺部疾病有较好的作用，这意味着对COVID-19能起一定治疗作用。同时，生姜还归经于脾经和胃经，具有温中止呕和解毒的功效。部分COVID-19患者表现出呕吐、腹泻等消化道症状[4]。因此，生姜对COVID-19 患者带的 “疫毒” 具有潜在解毒作用，还可能对脾胃等脏腑具有潜在保护作用。

生姜能作用于COVID-19 密切相关的靶蛋白，如IL2 诱导的T 细胞激酶（ITK），C-X-C 趋化因子受体2（CXCR2），细胞周期蛋白激酶CDK4，细胞周期蛋白CCND1 等（表4）。ITK 和CXCR2 蛋白与炎症反应密切相关。ITK 在T 细胞中表达并在T 细胞受体信号通路发挥核心作用[19]。在ITK敲除和ITK 激酶失活的转基因小鼠模型中，总IgE升高，减少肥大细胞脱颗粒，从而减少气道炎症和气道高反应性[19]。CXCR2 是感染后循环和肺浸润中性粒细胞中最主要的趋化因子受体，在白细胞募集和激活中起至关重要作用[20]。COVID-19 患者感染后炎症反应增强，血浆中炎症因子IL2、IL7、IL10、GSCF、IP10、MCP1、MIP1A 和TNFα 等表达水平显著升高，从而引发细胞因子风暴[6]。因此，生姜活性成分可能是通过ITK，CXCR2 等来调节COVID-19 患者的炎症反应，从而起防范作用。在Cdk4-/-小鼠中，肺损伤后，淋巴细胞募集受到损害，CDK4 参与了白细胞迁移与黏附，与机体免疫反应密切相关[21]。社区获得性肺炎患者的全血单核细胞中，CDK2 显著下降，CCND1 明显下降[22]。因此，生姜活性成分是通过多靶标发挥COVID-19防治作用的。因此，生姜还可通过CDK4 和CCND1等对炎症导致细胞损伤起保护作用。需要注意是是，本研究只选了生姜的3 种活性成分（药典含量测定指标成分），暂时未发现这3 个成分对COVID-19 研究热点靶蛋白ACE2 或Mpro 等有作用，这也说明了生姜在防治过程中起着辅助和调理作用。

生姜活性成分作用的18 个重要靶蛋白生物过程富集主要集中在炎症反应和免疫应答过程中，如白细胞分化，造血或淋巴器官发育，对细胞因子的反应，免疫系统的发育，T 细胞活化和白细胞激活等（图4）。SARS-CoV 感染过程中免疫效应细胞释放大量促炎性细胞因子和趋化因子，引发了细胞因子风暴，导致致命的不可控制的全身炎症反应[23]。这说明生姜可直接参与COVID-19 的炎症反应调节。同时，GO 富集还包括细胞表面受体信号通路、调控凋亡，翻译等一系列生物学过程，说明生姜对炎症因子导致机体损伤有改善保护作用。

KEGG 通路分析发现生姜活性成分参与了多种信号通路（表5）。排第1 位的非小细胞肺癌通路（Non-small cell lung cancer）与肺部损伤相关，排第3 位的病毒致癌通路 （Viral carcinogenesis）和第7 位的乙型肝炎病毒（Hepatitis B）与病毒感染有关，还有趋化因子信号途径（Chemokine signaling pathway）与免疫反应相关（表5）。这些通路直接与COVID-19 发生发展有着密切关系。值得注意的是，靶蛋白还参与了众多癌症通路，如非小细胞肺癌通路、肿瘤通路、胶质细胞瘤通路、胰腺癌通路、前列腺癌通路、膀胱癌通路、子宮内膜癌通路和急性骨髓性白血病通路等（表5）。研究报告癌症患者比非癌症患者更易感染COVID-19，且肺癌是最常见的类型，这些患者的预后较差[24]。推测生姜对COVID-19 患者的饮食调理有一定的帮助。

综上所述，本文以生姜活性成分6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚为研究对象，通过化学相似法预测作用靶点，人工数据挖掘病毒性肺炎疾病相关蛋白，交集获得生姜活性作用于病毒性肺炎的相关蛋白，并进行GO 富集和通路富集分析，构建了作用网络。发现生姜活性成分是通过多靶点和多信号通路作用于病毒性肺炎，具有多靶点和整体调节的特点。这为了解其防治COVID-19 提供理论依据，也为日常食物调理提供参考。