刘艳波 王焕琦 王洪俊 安丽萍 范春楠 包学英 贾晓静 李洁 黄琴扉 张玮尹 杜培革

摘要：为了探讨森林康养对人体免疫功能的影响，筛选12名健康志愿者于2019年7月上旬在吉林省长白山二道白河区森林康养基地进行为期“3天2夜”的康养活动。康养前后，利用流式细胞仪检测外周血CD56+ NK细胞和CD3+淋巴细胞的百分比，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血浆中颗粒酶、颗粒溶素和穿孔素的浓度。研究结果发现，长白山二道白河区夏季“3天2夜”的森林康养活动显著提高了外周血CD3+淋巴细胞和CD56+NK细胞的百分比（P<0.05），同时血浆中穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素的水平增加（P<0.05）。由此可见，森林康养活动在一定程度上可提高人体免疫功能。

关键词：森林康养，NK细胞，淋巴细胞，免疫活性，长白山

DOI： 10.12169/zgcsly.2020.12.04.0004

Abstract： To explore the effect of forest therapy in the summer on human immune function in Baihe District of Changbai Mountain， Jilin Province， the study screens and selects 12 healthy volunteers to have a three-day and two-night forest therapy there. The percentages of CD56+ NK cells and CD3+ lymphocytes in their peripheral blood are monitored using flow cytometry， and the concentrations of Grs， GNLY and perforin in plasma are tested using Elisa assay before and after forest therapy. The results show that compared with the pretest conditions， the forest therapy produces a significant increase in percentage of CD3+ lymphocytes and CD56+ NK cells （P<0.05）， and also an obvious increase in the perforin，GrA， GrB and GNLY levels in plasma. The results suggest that forest therapy activities can significantly increase human immune function to a certain extent.

Keywords： forest therapy， NK cell， lymphocyte， immunological activity， Changbai Mountain

森林康养是目前公认的缓解压力的有效途径之一[1]，相关学者通过研究发现：森林康养过程中自然杀伤细胞（Natural Killer Cell，NK）的数量和活性均增加[2-3];此外，森林康养还可缓解焦虑、愤怒等不良情绪。森林康养在日本和德国非常受欢迎，甚至作为药物的一部分进入国家医疗保险领域。有研究证实森林康养具有提高机体免疫功能的效应，主要由细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）和NK细胞完成，因为这些细胞内均含有穿孔素（Perforin）、颗粒酶（Granzyme，Grs）和颗粒溶素（Granulysin，GNLY）[4]。当淋巴细胞识别靶细胞后，颗粒酶会迅速释放到淋巴细胞—靶细胞突触中，通过多种途径诱导细胞死亡;穿孔素有助于颗粒酶进入靶细胞胞质发挥作用，该途径是CTL诱导细胞死亡的主要机制;颗粒溶素对多种微生物和肿瘤具有广泛的细胞溶解活性[5]。因此，NK和淋巴细胞数量的增加，穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素释放增多被视为增强免疫功能的关键指标。有学者已在日本进行了针对健康志愿者为期3天2夜的森林康养对免疫功能影响的研究，但由于地理位置不同、森林结构以及研究季节等诸多因素的差异，非常有必要进行对比研究。本文通过分析健康志愿者夏季在长白山二道白河区进行森林康养前后免疫功能相关指标的变化，明确森林康养能够提高免疫功能的相关机理。

1 材料與方法

1.1 研究区概况及研究对象

本研究在吉林省长白山二道白河区著名的风景地长白山天池附近开展，康养区分为休闲娱乐区、森林本底区和栈道休憩区，二道白河区夏季林分丰富，覆盖着大量的乔木和灌木，景色宜人，且森林步道完好，辅助设施完善。本次森林康养研究期间环境质量佳，适合康养活动[6]。

本研究从吉林市政府部门及当地大学筛选12名健康志愿者，其年龄介于50～60岁，平均年龄为（55.8±6.68）岁。所有志愿者均无心血管疾病、精神疾病史，3个月内未服用任何影响身心健康的药物，近期没有参加过森林康养或其他类似的旅行。所有志愿者在森林康养过程中三餐合理搭配，不可饮用含有酒精的饮料。该项研究符合北华大学医学伦理学要求，康养前，所有的志愿者均亲自签署知情同意书并详细填写调查问卷[6-8]。

1.2 康养过程

志愿者于2019年7月上旬在长白山二道白河区进行了为期3天2夜康养之旅，为防止情绪波动对康养效果产生影响，志愿者在酒店内可以随意活动，但要避免剧烈运动以及长时间浏览手机网页、打电话或其他影响睡眠的刺激性活动。本研究的康养活动与日本学者李卿教授[4]设计的森林浴相似。主要过程为：第1天下午，志愿者在广泛种植白桦、胡桃、松树、柏树和灌木的康养区漫步，时长为2 h;第2天，志愿者分别于上午和下午在林中步道各漫步2 h，森林漫步期间在栈道休憩区约进行1 h森林冥想，彻底放松;第3天一大早，志愿者抽取血样并完成问卷调查后返回吉林市。除午餐时间外，所有志愿者9∶00—17∶00停留在森林康养区。第1天和第3天早8∶00前完成采取及调查问卷工作。

1.3 测定指标及方法

为验证森林康养对免疫功能的影响，本研究分别于森林康养前后采集志愿者静脉血样，进行外周血CD56+ NK 细胞和CD3+ 淋巴细胞百分比检测，以及血清GrA、GrB、perforin和GNLY分泌水平检测。

1.3.1 主要试剂

本研究所用主要试剂有：抗CD3-FITC （ab34275）抗体和抗CD56-FITC （ab234250）抗体购自Abcam公司 （Cambridge， MA， USA）;人源性 GNLY Elisa kit（XL-Eh1850）试剂盒、人源性 Gra-A Elisa kit（XL-Eh1375）试剂盒、人源性Gra-B Elisa kit （XL-Eh1374）试剂盒购自美国Abcam公司（Cambridge， MA， USA）;其他均为国产分析纯试剂。

1.3.2CD56+ NK细胞和CD3+淋巴细胞百分比检测

抽取静脉血，采用乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）进行抗凝，抗CD56-FITC抗体和抗CD3-FITC抗体与100 μL 全血混合，分别与特异性的靶细胞结合，红细胞经氯化铵溶液处理后产生溶血，离心后，利用流式细胞仪检测NK细胞和淋巴细胞的百分比。

1.3.3 酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA）

制备血浆于4 ℃冰箱内保存。利用生物素标记的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测perforin、Grs和GNLY的水平。ELISA试验的主要过程为：首先将血浆加入事先包被好的孔板内，37 ℃孵育2 h后，将生物素标记的perforin、GrA、GrB和GNLY 抗体加入孔板内，与辣根过氧化物酶标记的链亲和素（streptavidin-HRP）形成复合物，孵育2 h后充分洗涤，除去未结合的酶;然后加入底物A和B以生成蓝色产物，该产物在酸的作用下转化为最终的黄色。颜色的深度与样品中靶分子的浓度呈正比。

1.4 统计学分析

利用配对的t检验检测康养前后相关指标的变化，使用Microsoft Excel software package作图，以P<0.05作为差异具有显著性的标准。

2 结果与分析

2.1 森林康养对外周血淋巴细胞及NK细胞百分比的影响

经过3天2夜的森林康养，志愿者外周血淋巴细胞的百分比明显增加（P= 0.049），NK细胞的百分比亦明显增加（P = 0.027）（图1）。

2.2 森林康养对穿孔素、颗粒酶及颗粒溶素释放的影响

NK细胞主要通过细胞毒颗粒的释放以及受体介导的凋亡途径诱导靶细胞死亡，一旦NK细胞接近欲杀死的靶细胞，perforin就从淋巴细胞释放，在靶细胞的胞膜形成微小孔道，Grs以及其他的相关分子将通过微孔道进入靶细胞内，造成细胞的凋亡。3天2夜的森林康养可显著提高志愿者血浆中perforin的水平（图2）（P= 0.011） ，同时，血浆中GrA（图2）和GrB（P=0.044）（图3）的水平明显增加。

GNLY可以借助其阳离子两性结构裂解细菌膜，并具有对线粒体和溶酶体膜的透化作用，能够杀死CTL或NK细胞靶向的其他细胞，是反映机体免疫功能的重要指标。本研究结果显示：为期3天2夜的森林康养明显增加CD56+ NK 细胞和CD3+ 淋巴细胞释放GNLY（图2）。

3 结论与讨论

3.1 结论

本研究于盛夏7月在长白山二道白河区进行为期3天2夜的康养活动，对比分析了森林康养前后全血CD3+淋巴细胞和CD56+NK细胞百分比变化以及血浆perforin、GrA、GrB和GNLY水平差异。研究结果发现：为期3天2夜的康养活动明显提高了CD3+淋巴细胞和CD56+NK细胞百分比，同时血浆中Perforin、GrA、GrB和GNLY的水平较康养前也明显增加。研究结果证实了夏季在长白山地区进行森林康养可以明显提高机体免疫功能，但具体机制尚需进一步探讨，本研究还存在需改进之处，如增加不同年龄段志愿者人数、适当延长康养时间，进行春、秋、冬季康养效果比较等，条件允许可进行动物实验，进一步探讨森林康养提高机体免疫功能的机理等。

3.2 讨论

本研究结果表明，森林康养后明显提高了血液中CD3+淋巴细胞和CD56+NK细胞百分比，同时血浆中Perforin、GrA、GrB和GNLY的水平较康养前也明显增加。说明森林康养可使免疫细胞短时间内进入外周血的数量增加，同时提高淋巴细胞和NK细胞的活性。这也可能是由于這些细胞在多种抗原（如芬多精）的刺激下被激活，它们通过颗粒胞吐途径将细胞内perforin、Grs和GNLY释放到细胞外，发挥相应的免疫功能。已有研究证实，如果将小鼠的perforin基因敲除，则NK细胞发挥细胞毒作用将大大降低[9-10]，说明NK细胞发挥细胞毒作用至少部分通过perforin起作用。前期研究已表明，森林康养可缓解健康及2型糖尿病人群的应激反应，使交感神经系统活性降低[6，8]，降低皮质醇分泌及大脑前额叶活动，但可增强副交感神经系统的活性，并使外周血中淋巴细胞增加[11-12]，这些淋巴细胞可释放大量的perforin、GrA、GrB和GNLY进入血液循环，直接攻击外来的异体细胞、体内突变的肿瘤细胞和病毒感染的细胞。其他研究还表明，一般情况下，Perforin和Grs均贮存在NK细胞、细胞毒T淋巴细胞及其他有核细胞的胞浆颗粒中，一旦这些细胞被激活，Perforin单体即可插入细胞膜，在钙离子作用下，多个perforin聚合成内径约16nm的通道，使Grs等多种毒蛋白迅速进入靶细胞。GrA既可直接激活Caspase，也可通过裂解IL-1发挥促凋亡效应;而GrB可直接降解Caspase底物、核基质抗原、核酶抑制剂催化亚基及核纤层蛋白而发挥抗肿瘤及抗微生物效应[13-14]。在杀伤异物的同时，Grs可通过正反馈途径迅速合成更多的Grs[15]，发挥更强大的免疫效应。GNLY主要由细胞毒T淋巴细胞和NK细胞分泌，在机体免疫应答过程中，GNLY与perforin和Grs等颗粒成分一起排出胞外，参与抗菌、抗病毒、抗寄生虫及杀伤肿瘤细胞等免疫过程[16]。因此，Perforin、GrA、GrB和GNLY的血浆水平在一定程度可以反应机体短时间内的免疫状况。

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