陈天贵，高 磊，李天博，王江宁

（首都医科大学附属北京世纪坛医院骨科，北京 100038）

挤压伤是交通创伤和自然灾害等导致的常见损伤，原发性损伤包括不同程度的软骨组织和肌肉损伤，伤后若无有效治疗，挤压解除后可合并挤压综合征、全身炎症综合征、多器官障碍综合征和急性肢体骨筋膜室综合征等，直接危及生命［1］。挤压伤综合征已是地震伤中除直接死亡的第二大死因［2］，危害严重。在灾难现场对挤压伤-挤压综合征实施早期治疗方法简单、方便，若治疗时间滞后挤压解除时间，肢体缺氧坏死产生的毒性物质回流入血会对各器官造成损伤［3］，因此积极有效的辅助干预措施对于缓解疾病有重大意义。脉络宁（Mailuoning）可降低缺氧/再灌注后血浆炎症因子水平，减轻肌细胞水肿现象，同时可保护细胞内超微结构完整性［4］，可减轻挤压伤综合征模型猪骨骼肌组织的氧化应激和细胞凋亡［5］，但具体机制尚未深入研究。Wnt/β-连接蛋白（β-catenin）通路是机体经典的模式分子信号通路之一，在缺血再灌注模型中Wnt/β-catenin 通路与缺氧再灌注损伤关系密切，且与Notch 通路关系密切［6］。推测脉络宁可能通过影响Wnt/β-catenin 和Notch 通路实现对挤压伤综合征的治疗作用。因此，本研究建立挤压伤动物模型，探讨脉络宁局部灌注对挤压伤综合征模型猪的保护机制。

材料和方法

1 实验动物

健康成年巴马小型猪24只，体重24～30 kg，购自首都医科大学动物实验中心，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0007，动物使用许可证号为SYXK（京）2019-0017。动物实验过程符合2006 年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》［7］。

2 药品、试剂及仪器

脉络宁注射液（金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，规格为每克10 mL，批号20190913）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号G1120）；Trizol 试剂和cDNA 第1 链合成试剂盒（天根生化科技北京有限公司，批号分别为KM1091、KR104）；猪白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor ne⁃crosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒，以及兔抗βcatenin、Delta 样配体4（Delta-like ligand 4，Dll4）、Notch 和 GAPDH 抗体（Abcam，批号分别为ab100754、ab100756、ab16051、ab270620、ab83232、ab8245）；辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（碧云天生物技术研究所，批号KL0069M）；总蛋白提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号BC3750-80）；组织核蛋白提取试剂盒（上海贝博生物科技公司，批号BB-31152-20T）。显微镜（北京佳源兴业科技有限公司，型号UB203i）；Spectra S/TEM 型透射电镜和ProFlex型RT-qPCR 仪（Thermo Fisher Scientific）；蛋白凝胶成像系统（Tanon，型号5200）。

3 方法

3.1 实验分组及模型制备 24 只巴马小型猪随机分为正常对照（normal control，NC）组、模型（model）组、常规灌注（model+NP）组和脉络宁灌注（MP）组，每组6只。按照参考文献［8］制作挤压模型，两块带齿金属夹板，中间设梯形凹槽固定猪肢体。除正常对照组外，其余各组参考文献［5］建立挤压伤模型，肌肉注射氯胺酮诱导麻醉、后耳缘静脉滴注丙泊酚彻底麻醉猪，将猪右后肢放入挤压模型带齿处，调整肢体使其股骨嵌入梯形卡槽中150 kg 恒定压力挤压，挤压5 h 后建模动物无死亡现象，均建模成功，在此过程中若猪麻醉缓解则追加丙泊酚剂量直至麻醉满意。正常对照组不做任何处理。

常规灌注组建模前右后肢挤压部位解剖出股动、静脉，股动、静脉插管并固定后用生理盐水浸润纱布覆盖切口，仅留置股、动静脉接头于体外，建模后血管夹夹闭近端股动、静脉，结扎可见的侧支循环，将系统动、静脉管路分别与猪股动、静脉接头连接，简易止血带阻断侧支循环，解除挤压。体外循环行自体同型血灌注（速度170 mL/min，温度10℃，时长1 h），膜肺装置（可替代肺脏功能）氧体积分数为10%，灌注过程中以50 mL/h 的速度滴入生理盐水，灌注完毕后拔除管路，压迫止血，松血管夹恢复自身血供，逐层缝合切口。脉络宁灌注组将灌注过程中的生理盐水换成脉络宁注射液，灌注体积、速度和时间均相同，且其余步骤相同。模型组只建立挤压伤模型，模型建立后即刻恢复自身血供，血管不进行任何处理。正常对照组不做任何处理。

3.2 样本采集 正常对照组和模型组建模后再灌注4 h，常规灌注组和脉络宁灌注组自体同型血灌溉结束4 h后耳缘静脉采血，右后肢实验部位胫前肌取标本，部分置于4%多聚甲醛中固定，部分置于戊二醛中固定，部分置于-80℃冰箱保存。

3.3 HE 检测骨骼肌组织形态 4%多聚甲醛中取出固定样本，经切片后HE 染色试剂盒染色，封片后显微镜下病变部位或与病变部位同位置处拍照。部分新鲜组织，肿胀程度用湿重/干重表示，血管破裂比例=破裂血管/总血管。

3.4 透射电镜观察骨骼肌超微结构 戊二醛中取出固定样本，常规透射电镜操作进行脱水、包埋、切片，透射电镜下观察骨骼肌超微结构。定量Z 线异常情况，Z 线异常百分率（%）=Z 线异常数/Z 线总数×100%。

3.5 ELISA 检测血清中IL-1β 和TNF-α 的水平 静脉血室温放置2 h，3 000 r/min 离心10 min，取上清，严格按照猪IL-1β 和TNF-α ELISA 试剂盒说明检测血清中IL-1β和TNF-α的水平。

3.6 RT-qPCR 检测骨骼肌组织中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的mRNA水平 −80℃冰箱取部分组织，剪碎后加Trizol试剂冰上匀浆并提总RNA，200 ng 总RNA 用cDNA第1 链合成试剂盒合成cDNA，RT-qPCR 扩增VEGF、MMP-2 和内参GAPDH。VEGF、MMP-2 和GAPDH 的引物由上海生工生物工程有限公司合成。VEGF 的上游引物序列为5’-CCTTGCTGCTCTACCTCCAC-3’，下游引物序列为5’-ACTCCAGACCT TCGTC⁃GTTG-3’；MMP-2 的上游引物序列为5’-GTC⁃GCCCATCATCAA GTTTC-3’，下游引物序列为5’-TCCTTCAGCACGAACAGGT-3’；GAPDH 的上游引物序列为5’-GGCAGCCCAGAACATCATCC-3’，下游引物序列为5’-GCCAGCCCAAGCATCAAA-3’。上样体系为20 μL：cDNA（50 mg/L）1 μL，F/R（10 μmol/L）各0.5 μL，SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 μL，ddH2O 8 μL。反应条件为：95℃3 min；95℃30 s，61℃45 s，40 个循环。2−ΔΔCt法计算骨骼肌组织中VEGF和MMP-2的mRNA水平。

3.7 Western blot 检测骨骼肌组织中β-catenin、Dll4和Notch 的蛋白水平 −80℃冰箱取部分组织，剪碎匀浆，蛋白提取试剂盒提取各组猪组织总蛋白检测β-catenin总蛋白、Dll4和Notch蛋白水平，部分组织核蛋白提取试剂盒提取核蛋白检测β-catenin 核蛋白水平，蛋白上样30 ng，SDS-PAGE 分离、PVDF 膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入抗β-catenin、Dll4、Notch 和GAPDH 的Ⅰ抗（均为1∶2 000 稀释）4℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗（1∶5 000稀释）室温孵育1 h，化学发光液显色，蛋白凝胶系统拍照并分析条带灰度，待测蛋白相对表达水平=待测蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。GAPDH为内参照。

4 统计学处理

用统计学软件SPSS 25.0 进行数据分析。计量数据以均数±标准差（mean±SD）描述，多组比较行单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 脉络宁对猪骨骼肌组织形态的影响

正常对照组肌纤维排列整齐，可见明显的横纹肌，无增生和肿胀或固缩现象，血管形态正常，无破裂；模型组肌纤维排列紊乱，肌核肿胀或固缩明显，肌膜皱缩，血管出现破裂、肿胀现象，肌间质水肿，炎症细胞浸润明显，与正常对照组相比组织肿胀和血管破损比例升高（P＜0.05）；常规灌注组肌纤维排列较模型组稍整齐，肌膜皱缩或肿胀，血管肿胀或破裂，与模型组相比组织肿胀和血管破损比例降低（P＜0.05）；脉络宁灌注组肌纤维较常规灌溉组排列整齐，肌膜皱缩或肿胀现象不明显，血管基本恢复正常，分别与模型组和常规灌注组相比组织肿胀和血管破损比例均降低（P＜0.05）。见图1、表1。

2 脉络宁对猪骨骼肌组织超微结构的影响

正常对照组骨骼肌丝排列紧凑且整齐，肌纤维I带、A线和Z线清晰可见且规则，细胞内细胞核位置、形态正常，线粒体、肌浆网形态均正常；模型组骨骼肌丝排列紊乱、出现溶解，肌纤维I 带、A 线和Z 线部分丧失，内质网和线粒体肿胀明显，肌核肿胀，出现大量的核聚集和核内移，与正常对照组相比，Z 线异常百分率升高（P＜0.05）；常规灌注组肌丝排列较模型组明显规则，形态稍微肿胀，间隙变窄，肌纤维I带、A线和Z线清晰，线粒体出现轻度肿胀，与模型组相比，Z 线异常百分率降低（P＜0.05）；脉络宁灌注组与正常对照组基本相似，肌丝排列紧凑且整齐，肌纤维I带、A 线、Z线清晰可见且规则，细胞核排列整齐，肿胀不明显，分别与模型组和脉络宁灌注组相比，Z线异常百分率均降低（P＜0.05）。见图2、表1。

Figure 1.Morphological changes of skeletal muscle of pigs in the 4 groups（HE staining，×200）.NC：Normal control；NP：normal perfusion；MP：Mailuoning perfusion.图1 4组猪骨骼肌组织形态情况

Figure 2.Ultrastructure of skeletal muscle tissue of pigs in the 4 groups（×3 000）.NC：normal control；NP：normal perfusion；MP：Mailuoning perfusion.图2 4组猪骨骼肌组织超微结构情况

表1 4组猪骨骼肌组织肿胀程度、血管破损比例和骨骼肌组织中Z线异常百分率的比较Table 1.Comparison of the swelling degree of skeletal muscle tissue and the proportion of vascular damage，and Z-line abnormal per⁃centage in skeletal muscle tissues in the 4 groups（Mean±SD. n=6）

3 脉络宁对猪血清IL-1β和TNF-α水平的影响

与正常对照组相比，模型组血清中的IL-1β 和TNF-α 水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，常规灌注组和脉络宁灌注组血清中的IL-1β 和TNF-α 水平降低（P＜0.05）；与常规灌注组相比，脉络宁灌注组血清中的TNF-α水平降低（P＜0.05），见表2。

4 脉络宁对猪骨骼肌组织中VEGF 和MMP-2 mRNA水平的影响

与正常对照组相比，模型组骨骼肌组织中VEGF和MMP-2 的mRNA 水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，常规灌注组骨骼肌组织中MMP-2的mRNA水平，脉络宁灌注组骨骼肌组织中VEGF 和MMP-2 的mRNA 水平降低（P＜0.05）；与常规灌注组相比，脉络宁灌注组骨骼肌组织中VEGF 和MMP-2 的mRNA 水平降低（P＜0.05），见表2。

表2 4组猪血清中IL-1β和TNF-α水平和骨骼肌组织中VEGF和MMP-2的mRNA水平的比较Table 2.Comparison of the serum levels of IL-1β and TNF-α，and the mRNA levels of VEGF and MMP-2 in skeletal muscle tissues in the 4 groups（Mean±SD. n=6）

5 脉络宁对猪骨骼肌组织中β-catenin、Dll4 和Notch蛋白水平的影响

比较β-catenin 总蛋白在各组间的差异无统计学显著性（P＞0.05）。与正常对照组相比，模型组骨骼肌组织中β-catenin 核蛋白/β-catenin 总蛋白、Dll4 和Notch 蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，常规灌注组和脉络宁灌注组骨骼肌组织中β-catenin 核蛋白/β-catenin 总蛋白、Dll4 和Notch 蛋白水平降低（P＜0.05）；与常规灌注组相比，脉络宁灌注组骨骼肌组织中β-catenin 核蛋白/β-catenin 总蛋白、Dll4和Notch蛋白水平降低（P＜0.05），见图3、表3。

Figure 3.Expression of β-catenin，Dll4 and Notch proteins in skeletal muscle tissues of the 4 groups.NC：normal control；NP：normal perfusion；MP：Mailuoning per⁃fusion；total：total protein；nucleus：nuclear protein.图3 4 组猪骨骼肌组织中β-catenin、Dll4 和Notch 蛋白表达情况

表3 4组猪骨骼肌组织中β-catenin、Dll4和Notch蛋白水平的比较Table 3.Comparison of β-catenin，Dll4 and Notch protein levels in pig skeletal muscle tissues of the 4 groups（Mean±SD. n=6）

讨 论

重物作用下会压迫骨骼肌，导致压迫对象遭受休克、肾衰竭等症状，造成再灌注损伤，累及全身器官，诱发挤压综合征［9］。本研究发现挤压伤后缺氧再灌注会损伤骨骼肌，血管出现破裂、骨骼肌中炎症细胞浸润现象，肌纤维、内质网、线粒体以及细胞核都出现损伤，细胞膜破裂，细胞核暴露，细胞损伤严重，组织肿胀、血管破损比例，Z 线异常百分率升高。脉络宁注射液主要成分为金银花、牛膝、石斛、玄参，清热养阴、活血化瘀，可扩张血管、增加血流量，同时可清除自由基、提高组织抗缺氧缺血和改善微循环能力［10］。常规灌注组肌纤维排列较模型组稍整齐，肌纤维I 带、A 线和Z 线清晰，肌膜皱缩或肿胀，血管肿胀或破裂，线粒体出现轻度肿胀，组织肿胀、血管破损比例，Z线异常百分率降低。单纯的生理盐水灌注可能通过稀释毒性物质作用，降低氧自由基水平，在一定程度上清除氧自由基、降低氧化应激和炎症水平，实现对组织的保护［11］，但能力有限，机体还会受到一定程度的损伤。而脉络宁注射液替换生理盐水灌注，肌纤维较常规灌溉组排列整齐，肌纤维I带、A 线和Z 线清晰可见且规则，细胞核排列整齐，肌膜皱缩或肿胀现象不明显，组织肿胀、血管破损比例，Z线异常百分率得到进一步缓解，血管基本恢复正常。可能是脉络宁扩张血管、增加血流量较迅速，本身对损伤部位抗氧化、清除自由基能力较强，从而改善损伤部位微循环，降低有害物质经血液流经全身各器官和组织，减少对机体的损伤。

IL-1β 在缺血缺氧损伤再灌注中增加兴奋性氨基酸的神经毒性作用，可使钙离子超负载、加速促凋亡基因，加速细胞损伤；可影响炎症因子水平加重损伤［12］。TNF-α 作为炎症启动因子，可激活多种炎症因子释放；亦可参与水肿过程，促进细胞、组织水肿［13］。VEGF属血管内皮细胞特有的促有丝分裂原，广泛存在于骨骼肌和心肌等组织中，在缺血再灌注中水平升高参与微血管病过程，拮抗VEGF 可减少脑缺血/再灌注损伤，从而实现在疾病状态下对机体的保护［14］。MMP-2主要底物包括罗明胶、胶原、层黏连蛋白和弹性蛋白等，再灌注后氧自由基增加升高MMP-2 水平，MMP-2 水平升高可使胶原、层黏连蛋白、弹性蛋白等降解，从而破坏血脑屏障完整性，增加血管通透性、加速炎症细胞侵入，促进脑水肿［15］。本研究发现，与正常对照组相比，模型组血清中IL-1β 和TNF-α 水平，骨骼肌组织中VEGF 和MMP-2 mRNA 水平升高，提示挤压伤综合征导致的缺血再灌注导致炎症细胞因子水平升高，增加神经毒性作用，增加钙离子负荷，导致血管通透性增加，加强炎症因子侵入、增加脑水肿，加重疾病进程。而脉络宁灌注可缓解上述功能，减轻挤压伤综合征的损伤。

Wnt/β-catenin 通路可调节软骨的成熟、分化、凋亡等过程，对软骨外基质分解代谢亦发挥重要作用［16］。在骨代谢过程中，Wnt 拮抗剂可缓解软骨肥大，并且在炎症过程中抑制MMPs 水平从而抑制VEGF 产生，减轻炎症反应［17］。Notch 参与多种信号通路的调节，且血管壁存在多种Notch 配体和受体，Dll4 作为Notch 配体之一，病理情况下病理血管激活Dll4/Notch 通路抑制血管内皮祖细胞迁移，从而加重疾病进程［18-19］。进一步研究发现Wnt/β-catenin 信号通路与Notch 信号通路相互影响从而发挥作用［20］。本研究发现，与正常对照组相比，模型组骨骼肌组织中β-catenin核蛋白/β-catenin总蛋白、Dll4和Notch蛋白水平升高，说明挤压伤综合征骨骼肌组织中Wnt/β-catenin 处于激活状态，激活Wnt/β-catenin 促进炎症因子的释放，从而促进增加MMP2 水平，增加毒性作用，增加钙离子负荷，同时促进VEGF 形成，导致血管通透性增加，加强炎症因子侵入、增加水肿，并且上调Dll4/Notch 通路抑制新生血管形成、抑制骨组织新生，加重疾病进程。而灌注后可改善上述症状，且添加脉络宁注射液后对Wnt/β-catenin 和Notch 的抑制作用加强，从而降低炎症水平，减缓毒性作用，减少水肿，实现对疾病的治疗作用。

综上所述，脉络宁局部灌注可抑制Wnt/βcatenin 和Notch通路，缓解炎症、及血管损伤，从而实现对挤压伤综合征的治疗作用。但脉络宁成分复杂，亦可能通过别的信号通路发挥作用，且并未研究不同时间点的差异，是挤压伤综合征进一步研究需要关注的课题。