郑杰，刘英丽，康进生，崔雪花，桑琳霞，李文玲

（1.河北医科大学第二医院神经外科，石家庄 050000；2.河北医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，石家庄 050017；3.河北省人民医院神经外二科，石家庄 050051）

原发性中枢神经系统淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）临床较少见，但近年其发病率呈增高趋势且预后不佳［1-3］。绝大多数PCNSL属于弥漫性大B细胞淋巴瘤，好发部位包括基底节区、胼胝体、额叶或脑室周围结构，也可发生于眼部、脑膜和脊髓。到目前为止，其发病机制仍不十分清楚，多发生于免疫功能缺陷人群［4］。有研究［5］认为，一些遗传因素可能作为其发病和预后的标志物。泛素特异性蛋白酶22（ubiquitin-specific protease 22，USP22）是一种新的肿瘤标志基因［6-7］，是新发现的一种人类去泛素酶，可表达于早期胚胎以及成人的各种组织中［8］。USP22是hSAGA的重要组成部分，通过对组蛋白H2A和H2B的去泛素化调控下游基因转录，而这些下游基因与肿瘤发生密切相关［6，9-12］。USP22的表达水平可以预测许多肿瘤的不良预后和治疗失败，如鼻咽癌、肝癌、胃癌等［13］。目前，USP22与PCNSL的关系还不清楚。因此，本研究主要探讨了USP22在PCNSL预后中的作用，为今后的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 病例收集

收集2010年1月至2016年1月于河北省人民医院神经外二科就诊、术后病理证实并进行放化疗的48例PCNSL患者的脑组织标本（PCNSL组织），同时收集27例脑挫裂伤患者挫伤灶脑组织标本（挫伤灶脑组织），所有组织均在手术过程中收集并及时放于液氮中保存。本研究所有患者均签署知情同意书，并通过伦理委员会审核。

1.2 RNA提取和实时定量PCR检测USP22 mRNA表达

采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法检测USP22基因在48例PCNSL组织和27例挫伤灶脑组织中的表达情况。采用Trizol（美国Invitrogen公司）提取脑组织中的总RNA，并用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Thermo Scientific）进行反转录。然后用Trans Start Top Green qPCR SuperMix［天根生化科技（北京）有限公司］试剂盒进行实时定量PCR。USP22引物：正向5’-TCAC CTCGAACTGCACCATA-3’，反 向5’-GAAGAAGTCCC GCAGAAGTG-3’。每个反应的终体积为20 μL，包括1 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，10 μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix，8 μL水。扩增循环参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 5 s，56 ℃15 s，72 ℃ 10 s，共40个循环。

1.3 Western blotting检测USP22蛋白表达

用冻存的PCNSL组织和挫伤灶脑组织提取总蛋白，并用Western blotting检测不同组织中USP22蛋白的表达情况。首先用SDS-PAGE分离总蛋白，将其转移至PVDF膜，并用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后用抗USP22抗体（1∶500，美国Abcam公司）4 ℃过夜孵育，用0.1%TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min；加入倍稀释的抗兔荧光抗体（1∶10 000，美国Abcam公司），避光室温孵育1 h，0.1% TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min。应用Odyssey V3.0软件对Western blotting条带进行定量分析。

1.4 治疗与随访

PCNSL患者术前均行头MRI（平扫+强化）检查，明确病灶部位、数量和大小后行立体定向穿刺活检，病理证实为PCNSL。治疗方案采用化疗+放疗。所有患者跟踪随访至2018年1月。所有相关信息均来自河北省人民医院神经外二科的病历记录，记录患者总生存期，进行预后分析。

1.5 统计学分析

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料以百分数表示，采用χ2检验进行比较。计量资料以或M（P25～P75）表示，采用t检验进行比较。采用Kaplan-Meier绘制生存曲线，采用Cox模型进行多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床和病理特征

本研究共纳入48例PCNSL患者，中位年龄52.4（28～74）岁。其中30例（62.5%）主要表现为头痛、头晕等颅高压症状，12例（25.0%）表现为肢体乏力、轻偏瘫等局灶性神经功能缺失症状，6例（12.5%）表现为情感障碍、记忆力减退等精神症状。按照不同年龄、不同性别等临床特征进行比较（表1），结果显示，USP22蛋白表达水平与肿瘤大小及病灶数量有关（P＜0.05），肿瘤直径越大、病灶数量越多，则USP22蛋白表达水平越高，而与年龄、性别等其他临床特征无关（P＞0.05）。

2.2 治疗和预后

PCNSL患者化疗方案为大剂量甲氨蝶呤单药化疗，中位疗程6（3～8）个疗程。放疗采用全脑放疗或局部放疗，中位放疗剂量30（19～60）Gy。平均生存期为（26.27±12.39）个月。

2.3 PCNSL组织与正常脑组织中USP22 mRNA和蛋白的表达差异

采用qRT-PCR检测PCNSL组织和挫伤灶脑组织标本中USP22mRNA的表达情况。结果显示，PCNSL组织USP22mRNA的表达水平明显高于挫伤灶脑组织（P＜0.001，图1A），说明USP22作为肿瘤标志物的重要性；PCNSL组织USP22蛋白表达水平也明显高于挫伤灶脑组织（图1B）。

2.4 USP22表达对PCNSL预后的影响

以各标本中USP22蛋白的表达水平平均值为标准，根据USP22蛋白的表达水平将PCNSL分为低表达组（蛋白表达水平低于平均值，n=22）和高表达组（蛋白表达水平高于平均值，n=26）。Kaplan-Meier分析结果（图2）显示，在经过放化疗后的PCNSL患者中，USP22表达水平越高，预后越差。Cox回归分析（表2）显示，USP22蛋白表达水平是PCNSL的一个独立预后影响因素，USP22表达水平越高，预后越差（P＜0.05）；同时，病灶数量也是一个独立影响预后的因素，病灶数量越多，预后越差（P＜0.05）。这些结果表明，USP22的高表达与PCNSL的发展进程和预后密切相关。

表1 USP22蛋白表达水平与PCNSL患者临床特征的关系Tab.1 USP22 protein expression and the clinical characteristics of patients with PCNSL

图1 USP22在PCNSL组织和挫伤灶脑组织中的表达情况Fig.1 USP22 expression in PCNSL tissues and brain tissues with contusion

图2 PCNSL患者的Kaplan-Meier分析Fig.2 Kaplan-Meier estimate of patients with PCNSL

3 讨论

PCNSL是一种发病率较低但预后较差的中枢神经系统肿瘤［14-15］。目前，一些临床和病理指标仍不能很好的预测其预后。因此，急需寻找新的诊断标志物以便制定治疗策略、预测治疗效果。近年来人们更多的关注肿瘤表观遗传学，尤其是基因标志物对肿瘤治疗效果和预后的评估作用［16］。泛素-蛋白酶体系统主要参与介导细胞内蛋白质降解代谢、细胞周期和转录调控、DNA损伤修复等多种细胞过程［16］。其泛素化过程具有可逆性，即通过去泛素化酶对底物蛋白的去泛素化调控蛋白质的寿命或功能。因此，去泛素化酶在维持细胞正常功能和某些病理过程中发挥重要作用。去泛素化酶分为6大类，泛素特异性蛋白酶家族（ubiquitin-specific protease，USP）是目前去泛素化酶中成员最多、结构最具多样性的一类［16］，其中以USP22最为重要。正常生理状态下，USP22广泛表达于人体各种不同组织，其中以骨骼肌和心脏表达最多，脑、肾脏和胰腺表达中等，肺和肝脏表达最少。目前研究［17-18］已经证实，USP22是一个重要的肿瘤标志基因，在许多肿瘤的发展进程中起着至关重要的作用，可以作为一些肿瘤的诊断和预后标志物。但是其与PCNSL的关系还鲜有报道。因此，本研究的主要目的是探讨USP22在PCNSL的发展和预后中的作用，为今后的治疗提供新的靶点。

表2 影响PCNSL患者生存的Cox多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of the survival of patients with PCNSL using Cox model

本研究共选择了48例PCNSL患者作为病例组，利用立体定向技术获取PCNSL组织标本，采用qRT-PCR检测USP22mRNA的表达情况，结果显示，PCNSL组织标本中USP22mRNA的表达水平高于挫伤灶脑组织。同时采用Western blotting分析USP22蛋白的表达情况，结果显示，PCNSL组织USP22蛋白的表达水平高于挫伤灶脑组织，与USP22mRNA的结果一致。而且USP22蛋白的高表达与病灶数量增多呈正相关。既往研究［17-18］表明，USP22可通过调节Survivin影响细胞凋亡，进而影响肿瘤的发生、发展和预后；可通过上调叉头框蛋白M1表达，促进β连环蛋白核转位，促使G1/S期细胞增多；通过调节转录因子，促进肿瘤细胞增殖和转移；通过调控细胞内STAT、TGF-β等多条信号转导通路参与肿瘤的发生过程。结合本研究结果，表明USP22在PCNSL的发生、发展过程中起到促进作用，其作用机制可能与文献报道相符。

为了进一步验证USP22蛋白表达与PCNSL预后的关系，本研究采用Kaplan-Meier分析验证USP22蛋白的高表达对放化疗后患者预后的影响。结果证实，USP22蛋白表达水平越高，患者预后越差。同时采用Cox回归模型进一步分析了影响PCNSL预后的因素，结果证实，USP22是一个独立影响PCNSL预后的因素。这些结果表明，USP22蛋白的高表达可以影响PCNSL的进程，降低放化疗治疗效果，造成患者预后不良，这与其在其他肿瘤中的作用一致。

总之，本研究证实了USP22可以促进PCNSL的进程，其高表达可引起患者预后不良，因此USP22可作为今后PCNSL的治疗靶点和预后标志物，但其功能和分子机制仍不十分清楚，需要进一步的研究来确定其具体的调控机制，为PCNSL的诊断和治疗提供新的靶点和方向。