关国欣，王冰，黄宝俊，赵丹懿

（1.大连医科大学附属第二医院急腹症外科，辽宁 大连 116027；2.大连医科大学附属第二医院肿瘤科，辽宁 大连 116027；3.中国医科大学附属第一医院肿瘤外科，沈阳 110001）

胃癌在我国发病率仅次于肺癌，近年来胃癌的发病率和死亡率逐年上升［1-2］。化学治疗（简称化疗）是治疗肿瘤最有效的方法之一。中国临床肿瘤学会对胃癌的一线治疗方案为氟尿嘧啶和铂类药物的联合治疗，如顺铂（cisplatin，CDDP）联合5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）。化疗能明显改善胃癌患者的预后，但化疗耐药严重限制了化疗的临床应用。因此，研究并发现提高化疗敏感性的方法尤为重要。

许多非编码RNA被证明参与肿瘤化疗耐药的发生和维持［3-4］。生长抑制特殊转录本5（growth arrest specific transcript 5，GAS5）降低膀胱癌细胞对阿霉素的耐药性［5］，尿路上皮癌相关1（urothelial carcinoma associated 1，UCA1）敲除抑制胃癌细胞对阿霉素的耐药性［6］。牛磺酸上调基因1（taurine upregulated gene 1，TUG1）是在视网膜发育的相关研究中发现并确定的［7］，其在膀胱癌和胶质瘤等多种肿瘤中存在异常的表达和功能［8-11］。TUG1在胃癌中高表达，能作为癌基因发挥作用，可以作为胃癌潜在的预后因子［12］。但TUG1在胃癌化疗耐药中的作用尚不清楚。本研究拟探讨TUG1与胃癌细胞对化疗药物CDDP和5-FU的敏感性的关系及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：76例胃癌及其癌旁正常组织均取自大连医科大学附属第二医院肿瘤科的标本库。本研究获得了大连医科大学附属第二医院伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。胃癌SGC7901细胞系以及多药耐药细胞系SGC7901/R由中国医科大学肿瘤外科惠赠。本组患者包括男52例，女24例，年龄43～71岁，中位年龄为61.2岁。纳入标准：所有患者均经胃镜活检及病理检测证实为胃癌，诊断前未接受其他治疗，均选择CDDP和5-FU联合化疗（新辅助化疗或姑息化疗）作为第一阶段的治疗方案。排除标准：患者病理资料不完整，或者患有其他疾病，包括其他肿瘤。所有患者接受2～4个疗程的联合化疗，通过影像学检查（增强CT）和胃镜检查来判断治疗效果。根据瘤体大小变化等评价治疗效果，将患者分为化疗敏感组（47例）和化疗不敏感组（29例）。

1.1.2 主要试剂：DMEM 高糖培养基和胎牛血清购自北京全式金公司；Trizol和Lipofectamine 3000购自美国赛默飞公司；SYBR RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司；Smart Silencer-TUG1（ss-TUG1）及阴性对照（ss-NC）购自广州锐博生物公司；增强型CCK8试剂盒购自上海碧云天公司；CDDP和5-FU购自美国Sigma-aldrich公司；pE-CTNNB1质粒及空质粒（pENC）购自上海吉玛公司；TOP Flash和FOP Flash荧光素酶报告质粒购自长沙优宝公司；双荧光素酶检测试剂盒购自北京威格拉斯公司；CTNNB1和GAPDH抗体购自云克隆公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染：SGC7901和SGC7901/R细胞均培养于含10%胎牛血清的培养基中，培养条件为37 ℃和5% CO2。将5×104SGC7901/R细胞接种在6孔板中，培养24 h。应用Lipofectamine 3000按照说明书操作，将Smart Silencer和（或）质粒转染SGC7901/R细胞，培养5～6 h，更换培养基后继续常规培养。

1.2.2 实时定量PCR：从组织或细胞标本中提取总RNA，检测RNA的纯度和完整性。以GAPDH为内参基因，应用SYBR RT-PCR试剂盒扩增TUG1基因。引物序列见表1。反应体系和反应条件参照说明书。应用比较CT值法对TUG1的表达量进行相对定量分析。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers used in the current study

1.2.3 药物敏感性检测：分别用CDDP（0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL）或5-FU（1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL）处理SGC7901/R细胞。按照说明书使用增强型CCK8试剂盒检测细胞活力。检测450 nm处的吸光度，并计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.4 荧光素酶实验：应用Lipofectamine 3000将荧光素酶报告质粒转染SGC7901/R细胞。采用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶为基线，肾素荧光素酶为内控，计算两者比值反映Wnt/CTNNB1信号通路的活性。

1.2.5 Western blotting：提取SGC7901/R细胞总蛋白，Bradford法进行蛋白定量。取30 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜，用脱脂牛乳4 ℃封闭过夜，经CTNNB1抗体杂交，二抗孵育，化学发光，凝胶成像仪获取图像。然后，利用Image J软件对图像中的谱带进行检测和分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行处理。每组实验重复5次，数据用表示。组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，2组独立样本均值比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TUG1的高表达与化疗敏感性相关

胃癌组织表达检测发现，TUG1在不敏感组胃癌组织中的的表达明显高于其在敏感组中的表达（图1A，P＜0.05）。

药物敏感性检测发现，SGC7901和SGC7901/R细胞CDDP的IC50分别为（1.83±0.23）μg/mL和（9.17±0.89）μg/mL，耐药指数（resistance index，RI）为5.01（图1B，P＜0.05）；SGC7901和SGC7901/R细胞5-FU的IC50分别为（5.23±0.48）μg/mL和（30.62±2.78）μg/mL，RI为5.85（图1C，P＜0.05）。SGC7901/R细胞对CDDP和5-FU的敏感性更低，耐药率更高。与组织表达检测结果相似，TUG1在多药耐药的SGC7901/R细胞中的表达高于其在亲本的SGC7901细胞中的表达（图1D，P＜0.05）。

2.2 TUG1沉默增强SGC7901/R细胞对CDDP和5-FU的敏感性

图1 TUG1的高表达与胃癌患者的化疗不敏感相关Fig.1 High TUG1 expression is related to chemotherapy insensitivity in GC

将ss-TUG1转染入SGC7901/R细胞可以显著降低TUG1的表达（图2A，P＜0.05）。药物敏感性检测发现，ss-NC组SGC7901/R细胞中CDDP和5-FU的IC50分别为（8.81±0.62）μg/mL和（31.02±2.64）μg/mL，而TUG1沉默组SGC7901/R细胞中CDDP和5-FU的IC50分别为（3.57±0.41）μg/mL和（8.42±0.93）μg/mL。TUG1的沉默能提高SGC7901/R细胞对CDDP和5-FU的敏感性。

2.3 TUG1沉默失活SGC7901/R细胞中的Wnt/CTNNB1信号通路

在肿瘤基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库中对450例胃癌样本进行共表达分析，结果显示，TUG1与CTNNB1呈显著正相关（图3A，r=0.324 9，P＜0.05）。其次，TUG1沉默抑制了SGC7901/R细胞中的萤火虫荧光素酶/肾素荧光素酶荧光比值，意味着Wnt/CTNNB1信号通路的活性降低（图3B，P＜0.05）。此外，TUG1沉默抑制SGC7901/R细胞CTNNB1蛋白的表达（图3C，P＜0.05）。因此，TUG1沉默能够失活SGC7901/R细胞中的Wnt/CTNNB1信号通路。

2.4 Wnt/CTNNB1信号通路介导TUG1对SGC7901/R细胞化疗敏感性的调节

与ss-TUG1+pE-NC组SGC7901/R细胞相比，ss-TUG1+pE-CTNNB1组SGC7901/R细胞的萤火虫荧光素酶/肾素荧光素酶荧光比值和CTNNB1蛋白表达均显著升高（图4A、4B，P＜0.05）。CTNNB1过表达能够激活由于TUG1沉默而失活的Wnt/CTNNB1信号通路。ss-TUG1+pE-NC组SGC7901/R细胞中CDDP和5-FU的IC50分别为（3.44±0.45）μg/mL和（8.21±0.87）μg/mL，ss-TUG1+pE-CTNNB1组SGC7901/R细胞中CDDP和5-FU的IC50分别为（7.26±0.86）μg/mL和（24.63±2.69）μg/mL（图4C、4D，P＜0.05）。ss-TUG1+pE-CTNNB1组SGC7901/R细胞中CDDP和5-FU敏感性明显低于ss-TUG1+pE-NC组SGC7901/R细胞。Wnt/CTNNB1信号通路的激活逆转了TUG1沉默对SGC7901/R细胞化疗敏感性的促进作用。

图2 TUG1沉默增强SGC7901/R细胞对CDDP和5-FU的敏感性Fig.2 TUG1 silencing enhances the sensitivity of SGC7901/R cells to CDDP and 5-FU

图3 TUG1沉默失活SGC7901/R细胞中的Wnt/CTNNB1信号通路Fig.3 TUG1 silencing inactivates the Wnt/CTNNB1 signaling pathway in SGC7901/R cells

3 讨论

越来越多的研究表明，非编码RNA在肿瘤的发生、发展中起着重要而复杂的作用。其中，lncRNAs因其数量众多、功能和机制复杂等特点，引起了研究者的广泛关注。lncRNAs被证明参与了肿瘤细胞的几乎所有生物学行为，包括化疗敏感性［13-15］。例如，神经母细胞瘤相关转录本1（neuroblastoma associated transcript 1，NBAT1）可以通过miR21/SOCS6途径抑制膀胱癌细胞的恶性表型［16］，核富集丰富转录物1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）作为癌基因促进胃癌细胞的恶性生物学行为和阿霉素抗性［17］。

在本研究中，TUG1在化疗耐药的胃癌组织和细胞系中表达上调，TUG1沉默能够提高SGC7901/R细胞对CDDP和5-FU的敏感性。这些发现证实了TUG1参与了胃癌化疗耐药的形成，但其机制尚不清楚。

生物信息学分析为研究TUG1在胃癌化疗耐药中的机制指明了方向。基于TCGA数据库的共表达分析证实TUG1与CTNNB1呈显著正相关，而CTNNB1是Wnt/CTNNB1信号通路的关键分子。此外，TUG1沉默能够失活SGC7901/R细胞中的Wnt/CTNNB1信号通路。Wnt/CTNNB1信号通路是一种经典的、被广泛研究的细胞内信号通路，参与多种细胞生物学功能和行为的调控［18-19］。研究［20-21］表明Wnt/CTNNB1信号通路在多种肿瘤（包括胃癌）化疗耐药的发生和维持中起重要作用。MA等［22］报道TUG1沉默能够失活肝细胞癌中的Wnt/CTNNB1信号通路。

图4 Wnt/CTNNB1信号通路介导TUG1对SGC7901/R细胞化疗敏感性的调节Fig.4 Wnt/CTNNB1 signaling pathway mediates the regulation of TUG1 in chemotherapy sensitivity in SGC7901/R cells

据此推测TUG1能够通过Wnt/CTNNB1信号通路参与调控胃癌的化疗耐药。为了验证这一假设，进行了一系列的拯救实验。结果发现，Wnt/CTNNB1信号通路的激活逆转了TUG1沉默对胃癌细胞化疗敏感性的促进作用，即Wnt/CTNNB1信号通路介导了TUG1对SGC7901/R细胞化疗敏感性的调节。然而，TUG1调控Wnt/CTNNB1信号通路的机制尚不清楚。

综上所述，TUG1与胃癌患者对CDDP和5-FU的化疗不敏感有关，TUG1沉默通过Wnt/CTNNB1信号通路促进胃癌的化疗敏感性。本研究结论有助于阐明胃癌的化疗耐药机制，同时为胃癌的生物治疗提供了新的靶点。