（中国医科大学附属第四医院眼科，沈阳 110005）

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是一种进行性、不可逆性、遗传性视网膜疾病［1］。常表现为夜盲、视野缺损和渐进性视力下降。RP一般先累及中周部视网膜，逐渐向后极部进展。这是由于光感受器细胞中的视杆细胞最先发生凋亡，随着疾病进展，视锥细胞也逐渐死亡［2-3］。目前已发现超过80种基因可导致RP。Spata7基因突变是导致早发型隐性遗传RP的关键基因之一，可致光感受器细胞早期死亡［4-7］。SPATA7蛋白表达于视网膜光感受器细胞中连接纤毛处，其突变导致光感受器细胞的连接纤毛破坏，引发光感受器细胞相关蛋白的内节到外节的转运障碍［8-9］。视紫红质蛋白（rhodopsin，RHO）位于光感受器细胞外节处，是维持光感受器细胞功能的重要蛋白。当RHO合成后无法被转运到光感受器细胞外节时，会停留在光感受器细胞内质网（endoplasmic reticulum，ER），导致ER应激，并发生光感受器细胞死亡［10-13］。部分RP是由于RHO在光感受器细胞ER内的非正常折叠或运输障碍造成。由此推测Spata7基因突变可能导致RHO在ER内聚集，发生ER应激，导致光感受器细胞死亡。

规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技术是近年来用于基因敲除的基因编辑方法，多用于全身目的基因敲除［14-16］。本研究首次运用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）作为载体，将CRISPR/Cas9系统搭载入视网膜，构建Spata7视网膜内敲除模型，验证了CRISPR/Cas9技术视网膜内靶向敲除的有效性，并进一步探讨了Spata7基因在光感受器细胞中的功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6基因背景的野生型小鼠在12 h光照和12 h暗适应下饲养。本研究严格遵守ARVO关于在眼科和视觉研究中的动物使用声明，实验方案获得中国医科大学伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 AAV载体的构建：运用http：//crispr-era.stanford.edu网站进行Spata7gRNA的设计，选取分数最高的gRNA（GTTCTGGACTTCGCTGGAGG）。将Spata7gRNA克隆进pTR-GRK1 AAV8载体，同时将GFP克隆入同一载体，形成AAV8-GRK1-GFP-Spata7gRNA结构。将Cas9单独克隆入另一载体，形成AAV8-GRKCas9载体结构。AAV8-Spata7gRNA和AAV8-Cas9的病毒浓度分别为3.15×1013和3.45×1013vg/mL。

1.2.2 视网膜下注射：AAV8-Spata7gRNA-GFP与AAV8-Cas9按 1︰1混合。将出生14 d的小鼠分为2组，实验组右眼注射1 μL AAV混合液，左眼注射等量PBS，对照组左右眼均注射1 μL PBS，以对照注射本身对左右眼带来的损伤。将小鼠麻醉后，用30号斜角针头在角巩膜缘睫状体平坦部进行浅穿刺，将35号钝针引入玻璃体腔并向腹侧推进，直到针尖穿过视网膜，用超微量泵Ⅱ和Micro4控制器将病毒悬液注入视网膜下间隙。

1.2.3 视网膜电生理检查：将小鼠置于暗室过夜后，在暗室内行暗适应视网膜电图（electroretinogram，ERG）检查，采用6个闪光强度（-34，-24，-14，-4，0，10 dB）记录a波和b波。

1.2.4 实时PCR：于注射1个月后摘取小鼠视网膜，三唑试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA，DNA酶Ⅰ（美国Invitrogen公司）处理，防止基因组DNA污染。反转录产生cDNA。采用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（美国Fisher Scientific公司）和StepOne实时PCR系统（美国Invitrogen公司）测定敲除后Spata7的mRNA表达水平，并用GAPDH进行标准化。Spata7上游引物序列为5’-TACCCGCCCATA AAGTCAAG-3’，下游引物序列为5’-CAGATGGGGA CAGTGATGTG-3’；GAPDH引物序列为5’-ACCCAG AAGACTGTGGATGG-3’，5’-CACATTGGGGGTAGG AACAC-3’。

1.2.5 免疫荧光检测及HE染色：处死小鼠后，取眼球置入Davidson’s fixative溶液固定过夜，脱水、包埋、切片，制成7 μm厚切片。切片脱蜡后行抗原修复，冷却后用1×PBS清洗。于0.5%TBS-Triton X中孵育20 min后，在含有10%山羊血清的缓冲液中室温孵育1 h，加入1︰500鸡抗GFP、1︰25小鼠抗Cas9、1︰500小鼠抗RHO抗体和1︰100兔抗CHOP，4 ℃孵育过夜。TBS洗涤，二抗（1︰500 Alexa Fluor®488结合山羊抗兔IgG、1︰500 Cy3®山羊抗鼠IgG、1︰500 Cy3®山羊抗鸡IgG）室温下孵育2 h。用1︰1 000 Topro3/DAPI和洗涤液对细胞核进行复染。最后，在载玻片上滴入长效防污剂（美国Life Technologies公司）。石蜡切片HE染色，所有切片取材位置相同，为靠近视盘中央处。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism5统计软件进行数据分析和图表绘制，采用独立样本t检验比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Spata7体内敲除后眼底照相

对AAV注射1个月后的实验组小鼠进行眼底照相，观察小鼠的视网膜损伤情况以及GFP的表达情况。如图1所示，在正常光频道下，可见AAV注射眼视网膜鼻上方及颞上方血管弓附近视网膜色素上皮萎缩、边界不清，视网膜鼻上方可见星状白色增殖膜，病灶面积约占视网膜10%～20%，病灶内继发色素增殖呈斑驳样，并伴有部分黄色渗出，视盘周围血管纹理清晰，色泽正常。病灶周边可见荧光着染，提示GFP在AAV注射眼视网膜细胞内大量表达。蓝光下可见与PBS注射眼相比，AAV注射眼有大量的GFP表达，几乎覆盖整个视网膜，表达效率约为80%。说明病毒注射成功，视网膜注射和病毒感染保持较高效率。

图1 视网膜下腔注射1个月后实验组小鼠眼底照相检查结果Fig.1 Fundus imaging results of mice in experimental group one month after injection

根据小鼠视网膜眼底照相结果确定病毒感染成功后，取实验组及对照组小鼠各4只行ERG，检查注射后光感受器细胞的功能。结果如图2所示，在不同光照强度下，对照组小鼠左右眼a波和b波数值接近（P＞0.05），且在正常数值范围内（在光强度为1 cd2/m2时，a波正常值为100～150 μV，b波正常值300～350 μV）。说明视网膜下腔注射不会对视网膜造成损伤。而实验组小鼠在不同光照强度下，AAV注射眼a波和b波均明显低于PBS对照眼，在光强度为1 cd2/m2时，a波降低约100 μV，b波降低约200 μV（P＜0.05），提示AAV注射眼光感受器细胞大量死亡。

2.2 Spata7基因体内敲除的效率

将4只注射AAV 1个月后的实验组小鼠处死，取视网膜行实时荧光定量PCR检测。结果显示，AAV注射眼Spata7的表达效率比PBS注射眼低54%，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明1 μL AAV病毒/CRISPR系统混合液（浓度3×1013vg/mL）行一次性视网膜下腔注射对Spata7基因的敲除效率为54%。

2.3 HE染色结果

HE染色结果如图3所示，对照组（左右眼均注射PBS）左右眼视网膜光感受器细胞层厚度一致且未见明显细胞死亡。进一步说明了视网膜下腔注射不会对光感受器细胞产生大的损伤，且左右眼注射水平相对一致。而实验组小鼠AAV注射眼光感受器细胞层（外核层）明显薄于PBS对照眼，意味着Spata7部分敲除后光感受器细胞大量死亡。

2.4 免疫荧光染色结果

免疫荧光染色结果显示，GFP和Cas9蛋白的表达基本覆盖整个视网膜，与眼底照相结果一致。AAV-Spata7-GFP-gRNA和AAV-Cas9病毒可感染同一光感受器细胞，实现了对细胞内Spata7基因的敲除（图4）。与PBS注射眼相比，实验组小鼠AAV注射眼ER内RHO大量表达于光感受器细胞内节，少量表达于外核层。同时，在AAV注射眼光感受器细胞内节中可见ER应激标记蛋白CHOP的表达（图5）。

3 讨论

图2 视网膜下注射1个月后2组小鼠ERG检查结果Fig.2 One month after sub-retinal injection，the results of ERG in the two groups were examined

图3 实验组和对照组小鼠的HE染色结果Fig.3 HE Staining results of the mice in experimental and control groups

图4 GFP与Cas9 蛋白的免疫荧光染色结果Fig.4 Immunofluorescence staining results of GFP and Cas9

图5 RHO和CHOP免疫荧光染色结果Fig.5 Immunofluorescence staining results of RHO and CHOP

为了研究Spata7基因突变后光感受器细胞死亡的机制，本研究首次运用AAV载体和视网膜下腔注射技术，在小鼠视网膜内建立了CRISPR/Cas9系统，对Spata7基因进行视网膜内特异性敲除。实验组小鼠眼底照相显示GFP高表达，免疫荧光显示GFP和Cas9蛋白广泛表达，qRT-PCR显示Spata7mRNA表达水平显著降低，均表明AAV感染及Spata7视网膜内敲除效率较高；实验组小鼠ERG a波和b波峰值显著降低，视网膜光感受器细胞层（外核层）明显变薄，表明光感受器细胞大量死亡，提示Spata7基因视网膜内敲除模型建立成功。该模型的建立，对比传统意义上利用CRISPR/Cas9技术构建Spata7基因敲除鼠，获得的效果等同，即敲除后早期即发生光感受器细胞大量死亡。但本模型的优势在于定点敲除视网膜内的Spata7基因，而全身其他器官的Spata7基因则被保留，因此，不影响小鼠发育及其他器官功能，尤其是公鼠的睾丸功能，保证了敲除鼠的生育能力。同时，该方法与利用Cre-Loxp系统构建的选择性敲除鼠相比，优势在于耗时少，方法简单，不需要进行筛选［17-18］，既避免了全身敲除对小鼠其他器官功能带来伤害，又大幅节省了研究时间，提高了研究效率。同为运用AAV作为载体搭载CRISPR/Cas9系统进入视网膜，另一研究团队用此方法对小鼠RHO基因进行了敲除，但其AAV对视网膜的感染效率仅为30%，目的基因的敲除效率也随之显著降低［19］。而本研究通过改进小鼠视网膜下腔注射的进针角度，大幅提高了AAV感染效率。小鼠视网膜下腔注射常规进针角度与水平面成45°，但本研究组发现由于出生14 d小鼠与成年鼠眼位有细微差别，导致斜行45°进针并不能保证注射位点靠近视网膜后极部，从而导致AAV感染效率降低，故将进针角度调高至75°～80°，保证了注射位点靠近后极部，大幅度提高了AAV对视网膜的感染效率（80%），保证了CRISPR/Cas9系统对Spata7基因的有效敲除。

本研究对Spata7基因视网膜内敲除1个月后光感受器细胞的死亡机制进行了探讨。结果显示，RHO在实验组小鼠AAV注射眼光感受器细胞内节中呈高表达，提示RHO滞留在光感受器细胞ER内。ER应激标记蛋白CHOP在小鼠AAV注射眼光感受器细胞内节中高表达，意味着RHO在ER内的聚集引发了ER应激。说明视网膜内敲除Spata7基因后，RHO不能被转运到光感受器细胞外节，而停留在了ER，造成了ER应激，导致光感受器细胞凋亡。

本研究也存在局限性：仅探讨了AAV注射1个月后Spata7基因的敲除情况及敲除后的光感受器细胞死亡情况，关于AAV搭载的CRISPR/Cas9系统对Spata7基因的远期敲除效应还有待继续研究；仅对AAV注射眼和PBS对照眼的光感受器细胞死亡情况和RHO运输情况进行了比较，未对AAV注射眼内不同AAV注射效率区域之间进行比较；Spata7视网膜内的敲除效率还可进一步提高。对此，可将常用的、分子量较大的SpCas9改为近年新发现的、分子量较小的SaCas9，使Cas9、gRNA和GFP 包装进入同一AAV载体，以克服AAV载体容量有限不能同时搭载这三者的局限性［20］，同时在此基础上可设计多个gRNA同步定位Spata7基因，以提高敲除效率。