刘梦婷，罗飞亚，曾建国

（湖南农业大学，中兽药湖南省重点实验室，兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，湖南长沙 410128）

饲料在长期贮存中易产生氧化、腐烂及霉变现象,导致其营养价值降低［1］。为了延长饲料的贮存时间,常常在饲料中添加抗氧化剂、防腐剂和防霉剂,但目前使用的饲料添加剂多是化学类添加剂［2-3］。由于过多地使用此类添加剂,动物源食品已经严重受到污染,进而影响到人类的健康。而植物精油是从从植物中提取的一类天然物质,不仅具有较强的抗菌抗氧化作用［4-5］,更由于其绿色安全的特点被越来越多的人关注。研究表明,在仔猪饲料中添加牛至油,可提高平均日增重,同时提高饲料转化率,且治疗仔猪下痢也有很好的疗效［6］。在肉鸡基础日粮中分别添加植物精油,对42 d龄肉仔鸡的血清抗氧化指标有正向调节作用,表明植物精油在清除自由基方面有一定的作用［7］。柴向华等［8］通过测定抑菌圈等体外抑菌实验研究了罗勒精油、百里香精油、牛至精油等13种植物精油对6种常见有害微生物的抑菌作用。结果表明,13种植物精油均对细菌、真菌、霉菌具有一定的抑杀能力。因此,植物精油的开发和应用前景十分广阔。

石香薷Mosla chinensisMaxim.系唇形科石荠苎属一年生草本植物,有细叶香薷、小香薷、野香薷等别称,广泛分布于我国长江以南地区。石香薷在民间以全草入药,具有治疗中暑发热、感冒恶寒、胃痛呕吐、急性肠胃炎、痢疾等作用［9］。石香薷精油是从石香薷全草中提取的挥发油,具有浓烈的香气。研究表明石香薷精油具有较强的抗菌和抗氧化活性［10-11］,目前对石香薷精油的应用报道主要集中在植物杀虫剂方面［12-13］,但其在饲料添加剂方面的应用报道较少。本研究通过GC-MS法分析石香薷精油中的化学成分,并研究其抗菌、抗氧化活性,旨在寻找一种天然高效的饲料添加剂,同时也为充分开发利用石香薷提供新思路。

1 材料

1.1 仪器 98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；PL203电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；UV2400型紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；Nano Quant infinite M200Pro TECAN酶标仪（瑞士Tecan公司）；ZHWY-103D型台式恒温振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）；SPX-150型生化培养箱（北京市永安光明医疗仪器厂）；LDZF-75KB-Ⅱ型立体蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；GCMS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪、GC/MS solution色谱工作站和NIST.17质谱数据库（日本岛津公司）；移液枪（Gilson PIPETMAN®L手动单道移液器,法国Gilson公司）。

1.2 材料 石香薷干燥全草（湖南新宁）,经湖南农业大学曾建国教授鉴定为正品。DPPH （50 mg/瓶）、总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法）（上海碧云天生物技术有限公司）；吐温-80；无水硫酸钠（分析纯,500 g/瓶,国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸丙酯 （PG,化学纯,100 g/瓶）、抗坏血酸 （Vc,1 g/瓶,阿拉丁）；正己烷（色谱纯,德国Merck公司）；无水乙醇（分析纯,国药集团化学试剂有限公司）；TPYPTONE （胰蛋白胨）、YEAST EXTRACT （酵母粉）,均购于美国OXOID公司；氯化钠（分析纯）、琼脂粉（国药集团化学试剂有限公司）。大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,所有供试菌种均来自中国典型培养物保究藏中心（CCTCC）。盐酸金霉素（纯度94.1%,生产批号130306-201419,中国食品药品检定研究院）。

2 方法

2.1 石香薷精油提取 将石香薷干燥全草切断（1 cm左右）,称取200 g,用水蒸气蒸馏装置提取样品中的精油,同时考察时间对精油提取的影响；将精油收集后用无水硫酸钠干燥并装瓶于低温处保存备用。

2.2 石香薷精油成分测定 CD-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；进样口温度240 ℃；注入方式无分流；载气高纯氦气 （99.99%）；载气气体体积流量1 mL/min。程序升温条件为初始温度40 ℃,保持2 min,以2 ℃/min升至120 ℃,保持1 min,继续以5 ℃/min升至200 ℃,保持2 min,分析检测时间共计61 min。

离子源为EI源；离子源温度为200 ℃；接口温度为220 ℃；电离能量为70 eV；质荷比质量扫描范围为m/z45～500；溶剂切除时间2.5 min,采集时间为58.5 min。

2.3 石香薷精油抗氧化活性测定

2.3.1 对DPPH·清除率 准确称取0.019 7 g DPPH·溶解于无水乙醇中,定容于250 mL棕色量瓶中,即配制成2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液,低温储藏备用；另取适量精油用无水乙醇溶解,分别配制成质量浓度为1、5、10、20、40、80 μg/mL的精油乙醇溶液,低温储藏备用。

参照文献［14-15］中的方法。吸取2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液,再加入2 mL无水乙醇,至于具塞试管中,记作A0；另取2根具塞试管各加入2 mL 1 μg/mL的精油溶液,然后分别加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液、2 mL无水乙醇溶液,分别记作Ai和Aj。用力摇匀。将A0、 Ai、 Aj所表示的样品在室温暗处静置反应30 min,加入比色皿中在波长517 nm处进行吸光度的测定,以无水乙醇作为对照调零,分别测出A0、 Ai和Aj所示样品的吸光度值。同理分别测定出5、10、20、40、80 μg/mL的精油溶液的吸光度值,并用PG和Vc做阳性对照。石香薷精油的清除率（SR）计算公式为SR=（1-（Ai-Aj）/A0）×100%。

2.3.2 总抗氧化能力（FRAP法）参照文献［16-17］进行。96孔板的每个检测孔中加入180 μL FRAP工作液,空白对照孔中加入5 μL蒸馏水,样品检测孔内分别加入5 μL 0.1%石香薷精油溶液。以Trolox作为阳性对照。37 ℃孵育3～5 min在593 nm处测定其吸光度。以FeSO4标准溶液测定绘制标准曲线,样品的总抗氧化能力以FRAP值来表示,1 FRAP值与1 mmol/L FeSO4相当。

2.4 抗菌活性 采用滤纸片扩散法［18-19］,将一定量的石香薷精油用1%吐温-80水溶液稀释成25%精油溶液。在无菌条件下,将滤纸片（d=6 mm）浸入已配置好的精油溶液中,取出自然风干,贴到涂抹适宜浓度菌悬液（1×106～107CFU/mL）的培养基平板上,每皿2片并以吐温-80水溶液作对照,重复3次,37 ℃培养12 h,十字交叉法测定抑菌圈大小［20-21］。

2.5 最低抑菌浓度（MIC）采用二倍稀释法［22］,将石香薷精油用1% 吐温-80水溶液稀释成体积分数为160 μL/mL的溶液。取无菌试管10支,排成一排,编号1～10。除1号管中加入1.6 mL LB培养基,其余各管各加入1 mL。然后再加入0.4 mL精油溶液至1号管,混匀,从1号管中吸取1 mL液体加入至2号管,混匀后吸取1 mL加入3号管,以此类推,8号管中吸取1 mL液体弃去。9号管为不含精油溶液的生长对照,10号管为空白对照。然后在1～8号每管内加入菌液1 mL,使精油体积分数最终为0.125～16 μL/mL,最终菌液浓度为1×106～107CFU/mL。将接种好的试管,于37 ℃培养6 h,然后吸取100 μL涂布琼脂平板,再于37 ℃培养12 h,观察,无细菌生长的为最低抑菌浓度。

精确称取盐酸金霉素适量,制备成质量浓度为5.12 mg/mL的母液,参照石香薷精油二倍稀释法进行稀释,取无菌试管10支,编号1～10。使1～8号管盐酸金霉素质量浓度最终为4～512 μg/mL,9号管为不含盐酸金霉素溶液的生长对照,10号管为空白对照。将接种好的试管,于37 ℃培养6 h,然后吸取100 μL涂布琼脂平板,再于37 ℃培养12 h,观察细菌生长情况,无细菌生长的为最低抑菌浓度。

3 结果与分析

3.1 石香薷精油提取及化学成分分析 测定结果表明,石香薷精油的提取率随着时间的延长而提高,当时间达到4 h后,提取率不再提高。本研究中石香薷精油的提取率为1.72%～1.85% （实际生产中,影响石香薷精油提取率的因素还有料液比、粉碎粒度、原料浸泡时间等）。总离子流图见图1。

图1 石香薷精油总离子流图

采用面积归一化法对各积分色谱峰占总峰面积百分比进行计算,再将GC-MS获取的石香薷精油成分的质谱数据,通过NIST.17谱库检索和人工仔细比对,参考文献［11-12］,本研究从石香薷精油中共检测出52种成分,鉴定了其中32种,见表1,相似度均达到84%以上,占总峰面积的97.84%。其中百里香酚、对伞花烃、α-松油烯、乙酸百里酚酯是其主要成分。

表1 石香薷精油化学成分鉴定结果

3.2 结果分析

3.2.1 总抗氧化能力 FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原（Fe3+-TPTZ）复合物,产生蓝紫色的（Fe2+-TPTZ）,利用酶标仪测定其吸光度,其变化与还原物质的含有量呈比例关系,并在593 nm处达到最大吸收,因此可作为样品总抗氧化能力的指标［23-24］。

由FeSO4标准曲线可知,其在0.15～1.5 mmol/L之间线性关系良好,回归方程为Y=0.351 9X+0.019 8 （r=0.998 2）,通过对石香薷精油总抗氧化能力测定,计算得出石香薷精油的总抗氧化能力的FRAP值为327.08±1.92,结果表明石香薷精油的抗氧化能力较强。

3.2.2 DPPH·清除 由图2可知,石香薷精油的IC50为1.92 μg/mL。石香薷精油对DPPH·的清除率与精油浓度呈现明显的量效关系,当石香薷精油的质量浓度到20 μg/mL时,对DPPH·的清除率达到饱和,而总体来看,石香薷精油的清除率要高于同质量浓度的PG和Vc溶液。抗氧化剂表现出来的抗氧化活性大小一般是酚类＞醛类＞醇类,石香薷精油中的化学成分以百里香酚、对伞花烃、香芹酚等为主要物质,因此有较强的清除DPPH·的能力。

图2 石香薷精油对DPPH·的清除率

3.3 石香薷精油及盐酸金霉素的抑菌活性结果分析

3.3.1 抑菌活性 石香薷精油的抑菌活性结果见表2,石香薷精油对4种供试菌均有抑制作用,抑菌活性强弱为金黄色葡萄球菌＞肠炎沙门氏菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌,对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好,对大肠杆菌抑制效果较弱。

表2 石香薷精油对不同菌种的抑菌活性（）

表2 石香薷精油对不同菌种的抑菌活性（）

3.3.2 石香薷精油和盐酸金霉素的MIC测定结果 表3显示,生长对照号管供试菌种正常生长,表明1%吐温-80溶液对其生长没有抑制作用,空白对照管无细菌生长,表明培养基未受到污染。由于不同菌种对石香薷精油的敏感程度不同,最低抑菌体积分数也各不相同。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌的MIC值为1 μL/mL,大肠杆菌的MIC值为2 μL/mL。可见,石香薷精油对其均有良好的抑制作用。

见表4显示,生长对照管供试菌种正常生长,表明蒸馏水对其生长没有抑制作用,空白对照管无细菌生长,表明培养基未受到污染。由于不同菌种对盐酸金霉素的敏感程度不同,最低抑菌体积分数也各不相同。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌的MIC值分别为128、8、32、64 μg/mL。可见,盐酸金霉素对不同菌种的抑制效果各不相同,其中对金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用。

表3 石香薷精油体外对4种病原菌MIC值

表4 盐酸金霉素对4种病原菌的MIC值

4 讨论

石香薷是我国重要的一种含有较多挥发油的植物,其精油含有量随着其生长期、部位及提取工艺的不同有较大差异［24-26］。本研究中石香薷精油的提取率为1.72%～1.85%,精油提取率较高。

本研究通过GC-MS分析石香薷精油化学成分,结果表明其成分以萜烯类为主,主要成分为百里香酚、对伞花烃、α-松油烯、乙酸百里酚酯、香芹酚等,和已报道结果相似［27-28］,张潇月等［29］研究报道,石香薷化学成分中未检测对伞花烃、α-松油烯、乙酸百里酚酯,而百里香酚和香芹酚含有量相对较高,可能是由于地域性差异导致。抗氧化活性实验结果显示石香薷精油清除DPPH·的能力与其浓度呈现一定的量效关系,表明其有较强的自由基清除能力和抗氧化能力。通过测定石香薷精油对4种细菌的抑菌活性,发现石香薷精油对不同种类细菌具有良好的抑菌活性,尤其是对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌展现出较强的抑制作用,而石香薷精油中的帖烯类物质可能在其较强的抗菌抗氧化能力而发挥主要作用［30-31］。在设置的阳性对照中,其抑菌效果不明显,仅对金黄色葡萄球菌具有一般抑菌效果,对其他3种菌的抑制效果较差,石香薷精油抑菌效果明显优于盐酸金霉素。

本研究表明石香薷精油具有良好的抗菌抗氧化作用,可作为一种新的天然、绿色、无毒的饲料添加剂开发应用,前景广阔。同时希望通过更深入的研究挖掘出更多芳香植物精油［32-33］,以便在将来替代化学类添加剂应用于人们生活中的各个领域,有利于人类健康。