李双双李 希 邓 谦施崇精冯建安黄 嫣王 玉

（1.成都中医药大学药学院，四川成都 611137；2.四川省中医药科学院中医研究所，四川成都 610031）

椒香温中止痛软膏由延胡索、肉桂、白芍、夏枯草等药材加工制成,具有温中散寒、行气止痛的功效,临床上主要用于治疗脾胃虚寒引起的脘腹冷痛。方中延胡索性味辛、苦、温,具有活血、利气、止痛的功效,主要成分为生物碱,包括延胡索乙素、延胡索甲素、脱氢紫堇碱等［1-3］；白芍具有缓急止痛的功效,主要成分为芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸等,有着抗炎、抗肿瘤、抑菌等药理作用［4-6］；肉桂性味辛、甘、大热,具有散寒止痛、温通经脉的功效,主要成分为挥发油,以桂皮醛含有量最高,约为84%,具有解热镇痛、抗炎、扩张血管等药理作用［7-9］；夏枯草性味辛、苦、寒,可反佐以制肉桂等之过热,主要成分为迷迭香酸,具有抗氧化、抗炎等药理作用［10-11］。该制剂临床应用多年,疗效显著,但其药味多样,仅检测单一成分难以全面反映其整体疗效,目前也尚无完善的质量评价方法。

因此,本实验在查阅相关文献的基础上,建立HPLC法同时测定椒香温中止痛软膏中没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脱氢紫堇碱、桂皮醛的含有量,以期为该制剂的质量控制及药效研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器 DZTW型调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司；Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪 （美国 Agilent Technologies公司）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；BT-125D型电子天平［十万分之一,赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。

1.2 试剂与药物 脱氢紫堇碱（批号20040208,纯度98%）、延胡索甲素（批号20032606,纯度98%）、芍药内酯苷（批号20040106,纯度98%）对照品均购自成都市卓谱仪器有限公司；没食子酸（批号110831-200803,纯度90.10%）、桂皮醛（批号110710-201821,纯度99.60%）、芍药苷（批号110736-201943,纯度98%）、延胡索乙素（批号110726-201819,纯度99.8%）、迷迭香酸（批号11871-201706,纯度90.5%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。椒香温中止痛软膏（批号20200401、20200402、20200403）由四川省第二中医医院制剂室生产。甲醇、磷酸为色谱纯（美国Tedia公司）；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相甲醇（A）-0.1%磷酸 （B）,梯度洗脱 （0～10 min,5% A；10～15 min,5%～30%A；15～42 min,30%～38%A；42～60 min,38%～39%A；60～72 min,39%～50% A；72～83 min,50%～90% A）；体积流量0.9 mL/min；柱温30 ℃；检测波长272 nm （0～13 min）、230 nm （13～83 min）；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量,甲醇溶解后定容,制成贮备液 （含没食子酸1.034 3 mg/mL、芍药内酯苷1.002 5 mg/mL、芍药苷2.141 7 mg/mL、延胡索乙素0.332 9 mg/mL、延胡索甲素 1.109 4 mg/mL、迷迭香酸0.787 4 mg/mL、脱氢紫堇碱1.075 1 mg/mL、桂皮醛3.600 5 mg/mL）,分别精密量取1.5、2、4、2、1、2、1、3 mL至20 mL量瓶中,甲醇定容,摇匀,即得（含没食子酸77.58 μg/mL、芍药内酯苷100.25 μg/mL、芍药苷428.33 μg/mL、延胡索乙素33.29 μg/mL、延胡索甲素55.47 μg/mL、迷迭香酸78.74 μg/mL、脱氢紫堇碱53.75 μg/mL、桂皮醛540.08 μg/mL）。

2.2.2 供试品溶液 取软膏（批号20200401）约2.0 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,密塞,称定质量,超声提取60 min,放冷,70% 甲醇补足减失的质量,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照处方比例和工艺流程,制备缺白芍、缺延胡索、缺夏枯草、缺肉桂的阴性样品,按“2.2.2” 项下方法制备,即得。

2.3 专属性考察 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图1。由此可知,各成分色谱峰与相邻峰均能达到有效分离,理论塔板数按各成分计均大于3 000,阴性无干扰,表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液5、3、2、1.5、1、1 mL,分别置于5、5、5、5、5、10 mL量瓶中,甲醇依次稀释至6个质量浓度（编号1～6）,在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X）,峰面积为纵坐标（Y）进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 精密吸取“2.4” 项下3号对照品溶液（含没食子酸31.03 μg/mL、芍药内酯苷40.10 μg/mL、芍药苷171.33 μg/mL、延胡索乙素13.32 μg/mL、延胡索甲素22.19 μg/mL、迷迭香酸31.49 μg/mL、脱氢紫堇碱21.50 μg/mL、桂皮醛216.03 μg/mL）,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6次,测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脱氢紫堇碱、桂皮醛峰面积RSD分别为1.64%、1.23%、0.77%、1.15%、1.13%、0.54%、1.59%、0.62%,表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一批软膏 （批号20200401）,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,分别于0、3、6、9、12、24 h,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脱氢紫堇碱、桂皮醛峰面积RSD分别为0.92%、1.87%、1.28%、0.95%、1.85%、2.69%、1.43%、1.56%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批软膏 （批号20200401）,按“2.2.2” 项下方法平行制备6份供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脱氢紫堇碱、桂皮醛含有量RSD分别为1.17%、1.63%、0.88%、1.63%、1.79%、1.53%、2.08%、1.02%,表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取同一批各成分含有量已知的软膏（批号20200401）6份,每份约1.0 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入“2.2.1” 项下贮备液适量,使其与各成分含有量之比均在1 ∶1左右,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脱氢紫堇碱、桂皮醛平均加样回收率分别为99.33%、99.95%、98.87%、100.28%、99.52%、97.82%、100.46%、101.08%,RSD分别为1.72%、1.13%、1.86%、1.77%、2.03%、1.71%、2.38%、1.10%。

2.9 样品含有量测定 取3批软膏,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,每批平行3份,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算含有量,结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg/g， n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg/g， n=3）

3 讨论

3.1 指标成分选择 椒香温中止痛软膏中没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脱氢紫堇碱、桂皮醛药理活性以抗炎、镇痛为主［12-15］,而且专属性强、重复性好,故选择其作为指标成分。另外,方中花椒、香附因其指标成分不明确、热稳定性差等因素未纳入定量测定中,而是采用TLC法作定性鉴别。

3.2 流动相、体积流量筛选 本实验考察了乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、［乙腈-甲醇（1 ∶1）］-0.1%磷酸、甲醇-水、甲醇-0.1% 磷酸,最终选择甲醇-0.1% 磷酸作为流动相；考察了0.8、0.9、1.0 mL/min,发现在0.9 mL/min体积流量下各成分峰形较好。再对甲醇、0.1%磷酸比例不断进行调节,最终确定为“2.1” 项下梯度洗脱程序。

3.3 检测波长筛选 本研究采用DAD检测器对各成分进行200～400 nm全波长扫描,考虑到既要与其他色谱峰有较好的分离度,又能同时将所有成分都检测出,最终确定为“2.1” 项下检测波长,此时各成分色谱峰峰形较好,响应值稳定,与其他相邻峰能达到有效分离。

3.4 供试品溶液制备方法筛选 本实验考察了提取溶剂（甲醇、70% 乙醇、70% 甲醇、50% 甲醇、1%盐酸甲醇）、提取方式（加热回流、超声、振摇）、提取时间（20、40、60、80、100 min）、料液比（1 ∶5、1 ∶10、1 ∶25、1 ∶50）,发现提取溶剂、提取时间、料液比对提取效果影响较大,而提取方式对其影响较小。考虑到实验操作、提取效率等方面,最终确定为“2.2.2” 项下方法。

4 结论

本实验建立HPLC法同时测定椒香温中止痛软膏中没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、延胡索乙素、延胡索甲素、迷迭香酸、脱氢紫堇碱、桂皮醛的含有量,该方法简便准确,重复性好,可用于该制剂的质量控制。