曹稳根，李梅梅，王 晴，段 红，翟科峰

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州 234000）

王枣子Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan为唇形科香茶菜属多年生草本植物,是该属少有的药食两用植物,主要分布于安徽省宿州市埇桥区夹沟镇等山区,是宿州当地有名的传统草药,民间常用于治疗疮疖、恶疮、肿瘤、肺结核、肺脓疡、老慢支等多种疾病,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗血栓、抗癌等药理作用［1-6］。大量研究表明,黄酮具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗类风湿关节炎、抗菌、抗病毒、抗癌、防治糖尿病肾病等多种药理活性［7-21］,越来越受到广泛关注,虽然王枣子茎叶中也含有丰富的该类成分［3,6］,但尚无关于其提取工艺的报道。

因此,本实验采用纤维素酶-超声辅助提取王枣子叶总黄酮,不仅能缩短提取时间,还可大大提高总黄酮提取率,同时优化该工艺,评价该成分抗氧化活性,以期为该药材开发利用提供依据。

1 材料

HK-04A 200 g型手提式粉碎机（广州市旭朗机械设备有限公司）；U-3310型紫外分光光度计（日本Hitachi公司）；XO-250型超声波细胞粉碎仪（南京先欧仪器制造有限公司）；RE-52型旋转蒸发器（上海青浦泸西仪器厂）；PH酸度计（德国赛多利斯公司）。芦丁对照品（中国食品药品检定研究院,批号100080-201408）；纤维素酶（上海源叶生物科技有限公司,活性50 U/mg）；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH,批号W3008E46572,美国Sigma公司）；其他试剂均为分析纯。王枣子叶购自宿州绿源中医药科技有限公司,经安徽中医药大学药学院周建理教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 药材预处理 将新鲜王枣子叶置于55 ℃烘箱中干燥2 h,控制其含水量在5% 以内,粉碎后过80目筛,装入干燥磨口瓶中备用。

2.2 总黄酮提取液制备 精密称取0.5 g “2.1”项下预处理药材,加入50倍量2%纤维素酶溶液,50 ℃下酶解6 h后在75 ℃热水中灭酶10 min［25］,冷却浓缩至粘稠状,按一定乙醇体积分数、料液比、超声功率、超声时间进行处理,滤液定容至100 mL量瓶中,即得。

2.3 总黄酮含有量测定

2.3.1 线性关系考察 精密称取干燥至恒定质量的芦丁对照品0.013 7 g,80%乙醇完全溶解后定容于25 mL量瓶中,得到0.548 mg/mL对照品溶液,精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL至25 mL比色管中,80%乙醇定容至10 mL,加入0.7 mL 5%亚硝酸钠溶液反应6 min,加入0.7 mL 10%硝酸铝溶液摇匀后静止6 min,再加入5 mL 10%氢氧化钠溶液混合均匀,80% 乙醇定容至25 mL,静置15 min,于510 nm波长处测定吸光度,平行3次,取平均值。以溶液质量浓度为横坐标（X）,吸光度为纵坐标（A）进行回归,得方程为A=11.134 0X+0.005 2 （r=0.999 8）,在0～0.12 mg/mL范围内线性关系良好。

2.3.2 得率测定 精密吸取“2.2” 项下提取液1 mL,按“2.3.1” 项下方法测定吸光度,平行3次,取平均值,计算总黄酮得率,公式为得率=（总黄酮质量浓度×提取液体积/预处理药材质量）×100%,预处理药材取自“2.1” 项下。

2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液1 mL,按“2.3.1” 项下方法测定6次吸光度,测得其RSD为0.84%,表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 精密称取同一批“2.1” 项下预处理药材6份,每份0.5 g,按“2.2” 项下方法制备提取液,各精密吸取1 mL,按“2.3.1” 项下方法测定吸光度,测得其RSD为1.12%,表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 精密称取同一批“2.1” 项下预处理药材6份,每份0.5 g,按“2.2” 项下方法制备提取液,各精密吸取1 mL,按“2.3.1” 项下方法每隔15 min测定吸光度1次,持续120 min,测得其RSD为1.21%,表明溶液在120 min内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取同一批“2.1”项下预处理药材6份,每份0.50 g,按“2.2” 项下方法制备提取液,各精密吸取1 mL,置于25 mL比色管中,精密加入对照品溶液1 mL,按“2.3.1” 项下方法测定吸光度,测得总黄酮平均加样回收率为98.90%,RSD为1.19%。

2.4 单因素试验 图1A显示,随着乙醇体积分数增加,总黄酮得率先升后降,在60% 时达到最大值13.96%；图1B显示,随着“2.1” 项下预处理药材料液比的增加,总黄酮得率先升后降,在1 ∶40时达到最大值15.07%；图1C显示,随着超声功率增加,总黄酮得率先升后降,在125 W时达到最大值13.63%；图1D显示,随着提取时间延长,总黄酮得率先升后降,在16 min时达到最大值为13.94%。因此,确定最佳单因素为乙醇体积分数60%,料液比1 ∶40,超声功率125 W,提取时间16 min。

2.5 响应面法 在单因素试验基础上,选择乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声功率（C）、超声时间（D）作为影响因素,总黄酮得率（Y）作为评价指标,采用4因素3水平响应面法优化提取工艺,因素水平见表1,结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

通过Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行拟合,得到二次多元回归方程为Y=14.24 +0.002 5A-0.068B+0.14C-0.055D+0.090AB+0.37AC-0.10AD-0.21BC+0.21CD-0.63A2-0.32 B2-0.49C2-0.31D2,方差分析见表3。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由此可知,模型P＜0.01,表明模型极显著；失拟项P＞0.05,表明模型拟合程度良好；变异系数为1.76%,表明模型精确度良好；信噪比＞4,表明模型可用于分析和预测；因素AC、 A2、 B2、C2、 D2具有显著影响（P＜0.01）；各因素影响程度依次为超声功率（C）＞料液比（B）＞超声时间（D）＞乙醇体积分数（A）。

响应面分析见图2～3。由此可知,超声功率与乙醇体积分数交互作用最强,曲线陡峭,等高线呈椭圆形,对提取工艺有显著影响；超声功率与料液比、超声功率与超声时间交互作用次之,曲线较陡峭,等高线呈椭圆形,对提取工艺有一定影响；乙醇体积分数与料液比、乙醇体积分数与超声时间交互作用较小,曲线平缓,等高线呈近圆形,对提取工艺无明显影响。

图2 各因素响应面图（三维曲面图）Fig.2 Response surface plots for various factors （three-dimensional surface plots）

图3 各因素响应面图（等高线图）Fig.3 Response surface plots for various factors （contour plots）

通过Design-Expert软件,得到最优工艺为乙醇体积分数64%,料液比1 ∶ 39,超声时间16 min,超声功率130 W,总黄酮得率为13.96%。再按上述优化工艺进行3批验证试验,测得总黄酮得率为13.92%,与预测值13.96% 接近,表明该工艺稳定可靠。

2.6 抗氧化活性研究

2.6.1 对DPPH·的清除作用 按文献［22］报道的方法,取5支具塞试管,加入0.1 mmol/L DPPH溶液各3 mL,再加入“2.2” 项下提取液各3 mL,摇匀后静置30 min,以无水乙醇调零,在517 nm波长处测定吸光度Ai；取无水乙醇、提取液各3 mL,混合后在517 nm波长处测定吸光度Aj；取无水乙醇、DPPH溶液各3 mL,混合后在517 nm波长处测定吸光度A0,平行3次,计算清除率,公式为清除率=［1-（Ai-Aj）/A0］×100%。

体系中的抗氧化物质通过提供电子与DPPH·的配对作用来使其褪色,依据其程度可以衡量清除活性强弱［22］。图4显示,对DPPH·的清除作用与总黄酮质量浓度呈正相关,在0.25 mg/mL时清除率达93.55%。

图4 总黄酮对DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effect of total flavonoids on DPPH·

2.6.2 对·OH的清除作用 按文献［23］报道的方法,取5支具塞试管,加入“2.2” 项下提取液各2 mL,再依次加入6 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL、1.5 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL、0.1%H2O2溶液0.5 mL,在37 ℃下反应15 min,在510 nm波长处测定吸光度Ax；以蒸馏水代替H2O2溶液,同法测定吸光度Ax0；以蒸馏水代替提取液,同法测定吸光度为A0,平行3次,计算清除率,公式为清除率=。

过氧化氢广泛存在于生物体和食物中,根据Fenton反应原理,当遇到还原性金属离子（Fe2+）时会释放出氧化能力很强的羟自由基（·OH）,水杨酸可与其反应生成有色物质,而当反应体系中含有能清除·OH的成分时,就会与水杨酸产生竞争作用,使有色产物生成量减少［22-23］。图5显示,随着总黄酮质量浓度升高,对·OH的清除作用不断增强,在0.07～0.09 mg/mL范围内更明显,其中在0.09 mg/mL时清除率达88%。

3 讨论

图5 总黄酮对·OH的清除作用Fig.5 Scavenging effect of total flavonoids on ·OH

响应面法以多元二次回归方程为函数估算工具,通过对回归方程进行分析来优化工艺参数,具有操作简便、预测准确的特点［24］。纤维素酶可破坏药用植物细胞壁,改善细胞壁通透性,促进黄酮内容物溶出,具有作用条件温和、耗时长等特点。超声提取利用其空化效应和搅拌作用来破坏植物细胞壁,具有时间短、节省溶剂等特点［25-26］。

本实验采用纤维素酶-超声辅助提取王枣子叶总黄酮,得到最优工艺为乙醇体积分数64%,料液比1 ∶39,超声功率130 W,超声时间16 min,总黄酮得率为13.92%。抗氧化活性实验结果显示,王枣子叶总黄酮对DPPH·的清除作用与其质量浓度呈正相关,在0.25 mg/mL时清除率达93.55%,而在0.09 mg/mL时对·OH的清除率达88%。由此可知,该方法稳定可靠,所提取的王枣子叶总黄酮不仅含有量高,而且抗氧化活性也较强,应用前景广阔。