吕东霞，禹 瑞，屈战果，范明松*

（1.郑州澍青医学高等专科学校，河南郑州 450064；2.上海雷允上药业有限公司，上海 201401）

芒果苷是芒果叶主要活性成分之一,也可从知母中提取得到［1］,具有抗糖尿病及其并发症、调节脂代谢、抗肿瘤、心血管保护等多种药理作用［2-4］,应用前景广阔,具有一定研发价值,但该成分口服吸收生物利用度仅为1.2%［5］,导致其药效发挥大打折扣。纳米技术在提高药物生物利用度方面的作用得到了医药工作者的公认,目前已有采用自微乳提高芒果苷生物利用度的报道［6］,但该方法需使用大量表面活性剂,存在溶血等风险［7］,故开发一种安全性较高的纳米给药系统具有重要意义。

如今,对固体脂质纳米粒［8-11］的研究较多,技术也较为成熟,该方法采用生理相容性良好的载体材料将药物包裹于其中,从而起到改变药动学、促进吸收、提高生物利用度的目的,而且表面活性剂用量远低于自微乳。因此,本实验制备芒果苷固体脂质纳米粒,并对其体内药动学进行考察,以期为其他相关制剂的开发提供参考。

1 材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪,配置二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；TM-14SB型集热式磁力搅拌器 （上海沉汇仪器有限公司）；FA1004B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；MD200-5型氮气吹扫仪（杭州奥威仪器有限公司）；AllegraTMX-22R型台式高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；H-7650型透射电镜（日本日立公司）；MixMax型涡旋混合器（合肥艾本森科研仪器有限公司）；Master-sizer型粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）。

芒果苷原料药（批号110331,纯度＞98%,天津市中新药业有限公司）；芒果苷对照品（批号111558-201608,纯度99.2%,中国食品药品检定研究院）；大豆卵磷脂（批号PC-98T,上海辅必成医药科技有限公司）；单硬脂酸甘油酯 （批号161025,北京凤礼商贸有限公司）；超滤离心管（30 kDa,美国Millipore公司）；泊洛沙姆188（WPEE587E,德国巴斯夫公司）。其他试剂均为分析纯。

SD大鼠,体质量（300±20）g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,动物生产许可证号SCXK（沪）2012-0002。

2 方法与结果

2.1 芒果苷含有量测定

2.1.1 色谱条件 Waters C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相甲醇-0.1% 磷酸（40 ∶60）；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长258 nm。

2.1.2 线性关系考察 将10 mg芒果苷对照品溶于100 mL甲醇中,得到100 μg/mL贮备液,甲醇依次稀释至20.0、5.0、1.0、0.1、0.05 μg/mL,作为对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X）,峰面积为纵坐标（Y）进行回归,得方程为Y=30.115 8X+5.217 4 （r=0.999 8）,在0.05～20.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 方法学考察 取 “2.1.2” 项下20.0、5.0、0.05 μg/mL对照品溶液适量,在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次,测得芒果苷峰面积RSD分别为0.12%、0.24%、0.18%,表明仪器精密度良好。取1 mL纳米混悬液至10 mL量瓶中,加入5 mL甲醇超声提取后流动相定容至刻度,过0.45 μm微孔滤膜,即得供试品溶液,平行制备6份,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得芒果苷峰面积RSD为1.38%,表明该方法重复性良好。取同一份供试品溶液,于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得芒果苷峰面积RSD为0.72%,表明溶液在24 h内稳定性良好。取1.0 mL空白固体脂质纳米粒混悬液至10 mL量瓶中,共9份,加入“2.1.2” 项下100 μg/mL对照品溶液0.5、1.0、1.5 mL各3份,再加入5 mL甲醇超声提取后流动相定容至刻度,过0.45 μm微孔滤膜,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得芒果苷平均加样回收率为99.31%,RSD为1.78%。

2.2 芒果苷固体脂质纳米粒制备 参考文献［8］报道的方法。取芒果苷10 mg、大豆磷脂30 mg、单硬脂酸甘油酯200 mg,置于10 mL无水乙醇中,70 ℃水浴溶解,作为油相；配制30 mL 0.5%泊洛沙姆188溶液,置于70 ℃水浴中加热,作为水相,在800 r/min搅拌速度下将油相滴加到水相中,继续搅拌3 h后超声（200 W）提取10 min （每提取3 s,间隔2 s）,低温固化,过0.45 μm微孔滤膜,0.5%SDS溶液补充体积至30 mL,即得。同法制备空白纳米粒混悬液。

2.3 包封率、载药量测定 取1 mL芒果苷固体脂质纳米粒混悬液至25 mL量瓶中,加入15 mL甲醇超声提取后流动相定容至刻度,过0.45 μm微孔滤膜,平行3份,HPLC法测得芒果苷平均总质量为332.86 μg；取纳米粒混悬液1 mL,置于超滤管中,12 000 r/min离心30 min,合并滤液,取1 mL至5 mL量瓶中,平行3份,HPLC法测得游离芒果苷平均质量为64.54 μg。按照文献［8］报道的方法测定包封率、载药量,测得3批纳米粒平均包封率为80.61%,载药量为3.16%。

2.4 形态观察 取芒果苷固体脂质纳米粒混悬液适量,蒸馏水稀释50倍后滴加于铜网上,自然干燥,2%磷钨酸染色6 min后置于透射电镜（TEM）下观察其形态,结果见图1。由此可知,纳米粒呈类球形或椭圆形,粒子之间无粘连。

图1 纳米粒TEM图Fig.1 TEM image for nanoparticles

2.5 粒径、Zeta电位测定 取3批芒果苷固体脂质纳米粒混悬液,蒸馏水稀释50倍后测定其粒径、Zeta电位,结果见图2～3。由此可知,纳米粒平均粒径为178.63 nm,PDI为 0.083,Zeta电位为-18.2 mV。

图2 纳米粒粒径分布Fig.2 Particle size distribution of nanoparticles

图3 纳米粒Zeta电位Fig.3 Zeta potential of nanoparticles

2.6 冻干粉制备 为了增加芒果苷固体脂质纳米粒稳定性,并便于大鼠灌胃给药,本实验将其进一步制成冻干粉。在纳米粒混悬液中加入5%乳糖后混匀,分装于2 mL西林瓶中,置于-60 ℃超低温冰箱中预冻2 d后迅速冷冻干燥2 d （15 Pa、-20 ℃）,缓慢升温至25 ℃并保持2 h,即得（芒果苷质量分数为0.578%）。

2.7 体外释药 采用透析袋法。以900 mL水（pH 1.2）为释放介质［12］,设定温度为37 ℃,转速为75 r/min,取适量芒果苷固体脂质纳米粒冻干粉至3 mL释药介质中 （以芒果苷计质量为20 mg）,以3 mL含相同原料药的甲醇为对照,置于透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da）,于0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、36 h各取样2 mL,并自动补加2 mL空白溶出介质,经0.22 μm微孔滤膜过滤,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,绘制体外释药曲线,见图4,可知原料药在4 h内基本释放完全,而纳米粒在前4 h属于快速释药期,4 h后属于缓慢释药期。再分别采用零级、一级、Higuchi、Weibull模型对纳米粒体外释药进行拟合,结果见表1,可知其更符合Weibull模型。

图4 芒果苷体外释药曲线Fig.4 In vitrodrug release curves for mangiferin

表1 模型拟合结果Tab.1 Results of model fitting

2.8 体内药动学研究

2.8.1 分组、给药及采血 12只大鼠随机分为2组,每组6只,给药前禁食12 h,自由饮水。将芒果苷及其固体脂质纳米粒冻干粉分别用0.5%CMCNa溶液和纯化水制成2 mg/mL混悬液,灌胃给予2组大鼠,给药剂量均为20 mg/kg （以芒果苷计）,于0.167、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h眼眶采血,3 500 r/min离心3 min后取上层血浆,低温保存。

2.8.2 血浆样品处理 将10 mg葛根素对照品溶于50 mL甲醇中,甲醇稀释至200 ng/mL,即得内标溶液。取“2.8.1” 项下血浆样品100 μL,加入内标溶液20 μL、甲醇1.0 mL,涡旋混合沉降蛋白,10 000 r/min离心15 min后取上层有机相,氮气吹除有机溶剂,加入100 μL甲醇复溶,置于带有内衬管的液相瓶中。

2.8.3 线性关系考察 取 “2.1.2” 项下20.0 μg/mL对照品溶液,甲醇依次稀释至2 000、1 000、500、250、100、20 ng/mL,各取100 μL,氮气吹干后加入100 μL空白血浆,作为血浆对照品溶液,混匀,按 “2.8.2” 项下方法处理,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X）,芒果苷、内标峰面积比值为纵坐标 （Y）进行回归,得方程为Y=0.240 9X+0.084 2 （r=0.992 9）,在20～2 000 ng/mL范围内线性关系良好。

2.8.4 专属性试验 取血浆对照品（20 ng/mL）（按“2.8.3” 项下方法制备）+内标、给药12 h后血浆+内标、空白血浆溶液,按“2.8.2” 项下方法处理,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图5。由此可知,芒果苷与内标分离度良好,血浆内源性物质不干扰测定。

2.8.5 方法学考察 取 “2.8.3” 项下20、1 000、2 000 ng/mL对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6次,测得芒果苷、内标峰面积比值RSD分别为8.67、3.06%、4.14%,表明仪器精密度良好。另取上述3个质量浓度对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得加样回收率在85.11%～92.39%之间。取含药血浆样品溶液适量,室温下于0、2、6、12、18、24 h在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得芒果苷、内标峰面积比值RSD为8.17%,表明溶液在24 h内稳定性良好。取不含内标的对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,以S/N约为10为定量限,约为3为检测限,测得两者分别为5.0、2.0 ng/mL。

2.8.6 分析结果 采用3P97程序统计矩模型计算主要药动学参数,结果见表2,血药浓度-时间曲线见图6。由此可知,纳米粒tmax、 Cmax、AUC0～t、AUC0～∞高于原料药（P＜0.01）,相对生物利用度提高至216.69%。

图5 芒果苷HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of mangiferin

表2 芒果苷主要药动学参数（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for mangiferin（， n=6）

表2 芒果苷主要药动学参数（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for mangiferin（， n=6）

注：与芒果苷比较,**P＜0.01。

图6 芒果苷血药浓度-时间曲线Fig.6 Plasma concentration-time curves for mangiferin

3 讨论

本实验制备芒果苷固体脂质纳米粒时,采用磷脂、单硬脂酸甘油酯作为混合载体,可防止药物被排挤出晶格,有助于增加其包封率、稳定性等［8,13］。张杰等［14］研究认为,在制备有机相时磷脂可能会与药物形成一种亲脂的药物-磷脂复合物［15-16］,可增加药物与载体的相容性［17］,从而提高其包封率；文献［18］报道,联合使用乳化剂有利于提高稳定性,降低纳米制剂粒径；本实验所用的泊洛沙姆188可提供空间位阻,防止纳米粒聚集,并且磷脂可能也会起到降低油水界面张力、提高乳化效率的作用。综上所述,磷脂在固体脂质纳米粒处方中具有多重作用。

芒果苷水溶性、脂溶性均较差［14］,从而影响了该成分溶出及透膜吸收,而且胃肠道菌群也会影响其稳定性［12,19］,导致其吸收生物利用度不理想。固体脂质纳米粒可显著增加芒果苷口服吸收,其原因可能为①纳米制剂可增加药物与胃肠道黏膜的接触几率,有助于其经胞间、淋巴转运等途径吸收；②将芒果苷包裹进纳米粒后可减少与各种酶的接触,从而起到保护作用；③处方中磷脂的存在有助于增加胃肠道渗透性［20］,增加纳米粒与胃肠道的生物黏附性［21-22］,最终增加药物被吸收进入血液循环的几率。