王亚琼，张华锋，周 坚

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏苏州 215104）

口服液中可作为甜味剂的辅料有糖浆、甜菊糖、蜂蜜等多个种类,甜菊糖因口感、糖浆因工艺复杂、甜度难以控制等原因,大部分的口服制剂仍以蔗糖应用最为广泛。2015年版《中国药典》 中合剂项下要求：除另有规定外,含蔗糖量应不高于20%［1］。另外蜂蜜作为蜜丸、煎膏剂及蜜汁饮片中重要的辅料,在我国中药产业中使用广泛。然而,近年来蜂蜜掺伪的现象较为严重,间接对中药的质量造成了不良影响［2-3］。判定蜂蜜是否掺伪,则需要结合处方量考察果糖、葡萄糖及麦芽糖的含有量及相关比值［4］。

电喷雾检测器（CAD）是一种新型的HPLC通用质量型检测器,可应用于各种非挥发或者半挥发化合物的检测,特别适合糖类等无紫外吸收或紫外吸收很弱的天然产物的分析［5］。与传统糖类分析使用的质量型检测器蒸发光散射检测器和示差检测器相比,CAD灵敏度、重现性更好［6］。故本研究先就HPLC-CAD及HPLC-ELSD 2种方法进行比较,使用更优HPLC-CAD方法测定了果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖的含有量,并应用于中成药中甜味剂的测定及蜂蜜类辅料的质量评价。

1 材料

Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪配Corona Veo电喷雾检测器（美国Thermo Fisher公司）；UFLC型LC-20岛津高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Alltech 3300 ELSD蒸发光散检测器（瑞士Buchi公司）；AG245电子天平（瑞士Mettler公司）。

果糖对照品（批号100231-201606,纯度99.7%）、 D-无水葡萄糖对照品（批号110833-201506,纯度99.9%）、蔗糖对照品（批号111507-201704,纯度100%）、麦芽糖对照品（批号100287-201604,纯度94.4%）及乳糖（批号100058-201605,纯度94.8%）均购自中国食品药品检定研究院；水 （美国 Millpore公司）；色谱乙腈 （美国Honeywell公司）。

中成药中甜味剂的测定样品来源于2018年国家药品评价性抽样小儿咳喘灵口服液114批及颗粒剂184批,其余样品来自江苏省药品抽样及苏州市药品抽样。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hon-Sugar色谱柱 （250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相乙腈-水（75 ∶25）；体积流量1 mL/min；柱温35 ℃。Corona电喷雾检测器,采集频率10 Hz,滤光片1 s,雾化器温度设定值为high。ELSD检测器,雾化气体积流量1.8 L/min；漂移管温度95 ℃,增益1。CAD图见图1。

2.2 对照品贮备液制备 分别精密称取果糖、葡糖糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖对照品各1 g,加水定容于50 mL,置4 ℃密封贮藏。

2.3 供试品溶液制备 精密量取小儿咳喘灵口服液1 mL,加水稀释并定容至20 mL,滤过,即得小儿咳喘灵口服液供试品溶液。取蜜丸类样品,剪碎,取约1 g,精密称定后置50 mL量瓶中,加水约40 mL,超声（350 W,40 kHz）15 min,放冷,加水至刻度,摇匀,滤过,即得蜜丸类样品供试品溶液。取蜜制饮片样品,粉碎,取约1 g,同蜜丸类样品制备供试品溶液。

2.4 线性关系考察 精密量取不同体积的果糖、葡糖糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖对照品贮备液至同一量瓶中,加水稀释至刻度,配成系列质量浓度的果糖、葡糖糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖混合对照品溶液。在“2.1” 项色谱条件下分别进样,以各对照品峰面积（Y）对其质量浓度（X）,并计算回归方程。逐级稀释对照品贮备液,在“2.1” 项色谱条件下分别进样,以3倍信噪比估算检测限。结果见表1。

2.5 精密度试验 取3种质量浓度的混合对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下连续进样6次,计算各组分的平均RSD,HPLC-CAD法测定果糖、葡糖糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖含有量的精密度分别为3.34%、4.19%、3.03%、3.57%、4.07%,HPLC-ELSD法测定果糖、葡糖糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖含有量的精密度分别为1.53%、3.26%、1.83%、3.45%、3.21%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取小儿咳喘灵口服液的供试品溶液6份,按“2.3” 项下制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,HPLC-CAD法测定果糖、葡萄糖、蔗糖含有量RSD分别为2.10%、3.21%、4.04%,HPLC-ELSD法测定果糖、葡萄糖、蔗糖含有量RSD分别为4.79%、1.04%、4.26%。表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取小儿咳喘灵口服液的供试品溶液,分别放置0、2、4、8、16、24 h后,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算各组分RSD,结果HPLC-CAD法测定果糖、葡萄糖、蔗糖RSD分别为3.96%、4.24%、3.93%。HPLC-ELSD法果糖、葡萄糖、蔗糖RSD分别为4.31%、4.48%、4.92%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取小儿咳喘灵口服液的供试品溶液,分别精密加入约等量对照品适量,滤过,在“2.1”项色谱条件下进样,测得回收率均在95%～105%之间,结果见表2。

2.9 样品含有量测定 114批小儿咳喘灵口服液蔗糖含有量介于0～15.53%,均未超过2015年版《中国药典》 中合剂项下规定的限度20%。但其中17批样品,涉及5家生产企业的蔗糖含有量高于3%,同时HPLC-UV法测出甜菊糖的含有量均低于定量限0.026 ng/mL。推测这些批次的样品中矫味剂以蔗糖为主,与执行标准处方描述“加入甜菊糖” 为矫味剂不一致。184批小儿咳喘灵颗粒剂样品中蔗糖含有量不同生产企业差别较大,蔗糖含有量介于2.14%～87.13%。结果表明不同企业在颗粒剂制粒环节中辅料的用量差别较大。制粒过程中辅料使用比例过大,导致浸膏量比例减少,建议标准中明确浸膏的相对密度及加入量,控制制剂中辅料的比例。见图2～3。

图1 小儿咳喘灵制剂中各成分CAD色谱图

图2 不同生产企业小儿咳喘灵制剂中蔗糖含有量频数分布图

图3 不同生产企业蔗糖含有量箱式图

表3 加炼蜜的中成药及饮片中糖类含有量推算标准

2015年版《中国药典》 一部“蜂蜜” 项下规定,蜂蜜中含蔗糖及麦芽糖分别不得过5.0%,果糖与葡萄糖的总量不得少于60.0%,果糖与葡萄糖含有量比值不得小于1.0。按不同成药及饮片炮制的炼蜜用量折算,结果见表3。据参考文献［2-3］中均提出药材中含有蔗糖,因此蔗糖含有量不予考虑。加炼蜜的中成药及饮片中糖类测定结果显示,果糖与葡萄糖含有量比值均大于1.0,麻仁润肠丸中麦芽糖的含有量超标,蛇胆川贝枇杷膏中辅料为蜂蜜,因处方量未公开,无法推算限度,但麦芽糖含有量偏高。根据含有量推算标准麻仁丸、疏风活络丸及蜜制款冬花的果糖与葡萄糖的总量均小于推算限度,可确定炼蜜质量存在一定问题。见表4、图4。

表4 加炼蜜的中成药及饮片中糖类含有量（%）

图4 加炼蜜的中成药及饮片中各成分CAD色谱图

3 讨论

糖类的分析方法有很多种,早期的有光度法、容量分析法等,目前,液相色谱法、气相色谱法、PMP衍生法等,新技术有气相-质谱连用、液相-质谱连用、核磁法、超临界流体等也用于糖类分析［7-12］。在药物分析领域中应用较为普遍的是液相法分离,ELSD和示差检测器检测,由于示差检测器对环境高,不能梯度分离样品,同时稳定性也受多个因素影响,不适合于大批量样品的分析,因此,本研究比较了HPLC-ELSD法和新型HPLC-CAD法的差异,CAD法比ELSD法的线性范围更宽广,灵敏度也更高,稳定性也非常适合大批量样品长时间的进样。同时,在仪器维护方面,由于CAD直接连接氮气为载气,低温分析,长时间分析稳定性高,而ELSD空气泵易产生水汽,长时间分析干燥管变色,检测池进水后将无法继续分析。

本研究采用HPLC-CAD法测定了国家评价性抽样中小儿咳喘灵口服液及颗粒剂中甜味剂的含有量,发现部分企业违规采用非标准规定的矫味剂投料；并对普通抽样中部分中成药及饮片中蜂蜜类辅料进行质量评价,发现部分中成药中加入的炼蜜质量存在一定的问题。HPLC-CAD法样品提取方法简单快捷,分析方法稳定可靠,以期为中成药中甜味剂的测定及中成药及饮片中蜂蜜类辅料的质量评价提供参考。