刘 哲，余孟杰，向海燕，威则日沙，任朝琴，杨正明，刘 圆

（1.西南民族大学药学院，四川成都 610041；2.阿坝师范学院药学院，四川阿坝州 623002；3.西南民族大学医药研究院，四川成都 610041）

七叶一枝花 （华重楼） Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara.的根茎为2015年版《中国药典》重楼项下收录品种之一［1］。甾体皂苷是重楼根茎主要活性成分,具有抗肿瘤、消炎、止血、抗菌、镇痛、镇静、抗氧化、免疫调节、抑制血管生成、保护肝脏与肾脏等作用［2-3］。2005年以前,全国几乎没有重楼人工种植,重楼与土壤肥力的关系少有学者研究。近十多年来,重楼种植已成规模,种植面积不断扩大,土壤营养状况不均衡会导致重楼根茎品质下降［4］,探讨七叶一枝花活性成分与其生长环境的关系可以为其种植提供参考。目前对于重楼活性成分与其生长环境的关系研究报道较少,主要以滇重楼为主,相关研究［5-9］结果显示在一定范围内,土壤营养与滇重楼皂苷含有量存在影响,对于七叶一枝花的报道几乎没有,土壤肥力是影响七叶一枝花皂苷含有量的重要因素,适宜的土壤条件是七叶一枝花高产优质的重要基础。

因此,在前人研究［10-17］的基础上以UPLC-ELSD为技术手段,采用外标法分析测定其皂苷含有量,拟用5个产地中6种皂苷含有量与相应土壤肥力指标含有量进行多元统计分析,探讨七叶一枝花皂苷含有量与土壤因子之间的量化关系。因此,对实地采集的10批样品进行质量分析与评价,以期揭示影响其皂苷积累的主导因子,为七叶一枝花的规范化栽培管理以及适宜生长区的确定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与药物 Waters Acquity UPLC® 超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；METTLER AE240电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-5200E型超声波清洗器（40 kHz、250 W,昆山超声仪器有限公司）；ProElut C18反相硅胶键合固相萃取柱（北京迪科马科技有限公司）。柴胡皂苷D （MUST-16060106）、纤细薯蓣皂苷 （MUST-15081110）、重楼皂苷Ⅰ（MUST-15061611）、重楼皂苷Ⅱ（MUST-15060810）、重楼皂苷Ⅵ（MUST-14071904）、重楼皂苷Ⅶ（MUST-14060302）均购于成都曼思特生物科技有限公司；偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基 （1 →3）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷、重楼皂苷H均由四川大学华西药学院张浩教授课题组分离所得（纯度≥98%）；甲醇（分析纯,成都市科龙化工试剂厂）；乙腈（色谱纯,美国Sigma公司）；蒸馏水［屈臣氏集团（香港）有限公司］。

1.2 材料 七叶一枝花样品自采于四川省不同地区,五点法采样,并收集根茎土壤,所有药材样品经四川大学华西药学院张浩教授和西南民族大学刘圆教授鉴定为正品。药材洗净,干燥,粉碎过3号筛,备用；土壤样品,捡出杂物后,风干,过20目筛,备用。信息见表1。

表1 样品信息

1.3 方法

1.3.1 皂苷含有量测定

1.3.1.1 色谱条件 ACQUITY UPLC® HSS C18色谱柱（2.1 mm×75 mm,1.7 μm）；流动相乙腈（A）-水（B）,梯度洗脱程序见表2；体积流量0.2 mL/min；柱温40 ℃；分析时间22 min；进样量2 μL；ELSD检测器,增益500,冷却模式；漂移管温度55 ℃；氮气压力40 psi （1 psi=6.895 kPa）。混合对照品图见图1,样品色谱图见图2。

表2 梯度洗脱程序

图1 混合对照品中各成分UPLC色谱图

1.3.1.2 溶液制备 对照品溶液、供试品溶液制备按照课题组已经建立的方法［17］。

图2 七叶一枝花根茎外标法各成分UPLC色谱图

1.3.2 方法学考察 按2015年版《中国药典》 方法考察稳定性、重复性、精密度,RSD值均小于1.9%；6种皂苷加样回收率分别为重楼皂苷Ⅶ96.43%,RSD为0.87%；偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→3）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷98.13%,RSD为0.54%；重楼皂苷H 97.68%,RSD为0.91%；重楼皂苷Ⅵ98.62%,RSD为0.78%；柴胡皂苷D 96.28%,RSD为1.28%；重楼皂苷Ⅱ96.45%,RSD为0.94%；纤细薯蓣皂苷98.36%,RSD为0.97%；重楼皂苷Ⅰ为95.67%,RSD为0.58%。

1.3.3 土壤肥力指标测定 土壤肥力指标测定参考《土壤农业化学分析方法》［18］,其中土壤有机质采用硫酸-重铬酸钾法,碱解氮采用碱解扩散法,速效磷采用钼锑抗比色法,速效钾采用乙酸铵提取-火焰光度法。

2 结果与分析

2.1 主要数值测定结果 将采集的10个生长地区的七叶一枝花根茎中6种甾体皂苷含有量测定结果（S1～S10）和构建的理想含有量（参考药材）（S0）的8个考察性状的最大值见表3,土壤肥力指标测定结果见表4。

2.2 灰色关联度分析法分析

2.2.1 建立矩阵 利用Excel软件,采用均值计算方法,公式

其中i=0,1,2,…,m； k=0,1,2,…,n,建立矩阵并进行无量纲化处理。设待评的七叶一枝花为m,评价指标为n；通过比较数列值与相对应的参考数列值的差的绝对值计算差序列值。

2.2.2 关联系数计算 各指标与理想值的吻合程度呈正相关,关联系数越大,表明某指标越接近理想值。计算各参评材料与理想材料的关联系数,结果见表5。

2.2.3 归一化处理与灰色关联指标 由表5可知,关联系数多,不易比较,因此有必要将各个时刻的关联系数集中为一个值,而求关联度平均值便是这种信息集中处理的一个方法。可求得各指标的关联度（ri）,再将其归一化处理可得各个指标的权重,结果见表6；灰色关联评价指标公式：,其中ωκ 为权重系数,将表5～6所得结果代入并计算,求出各指标的灰色关联评价指标,并对所得值大小进行排序,结果见表7。灰色关联度分析结果关联度排序为S3＞S10＞S9＞S5＞S7＞S6＞S4＞S2＞S1＞S8,关联度差异较大,最大差异达到了97.18%,能够很好的区分材料的质量优劣；其中品质排名前六名的七叶一枝花材料编号为S10、S3、S9、S5、S7、S6,并且均符合《中国药典》 规定要求。即影响七叶一枝花质量优劣的因素主要为其中6种皂苷的含有量。

表3 10批样品根茎中6种甾体皂苷含有量（%）

表4 土壤肥力测定

表5 关联系数

表6 指标归一化处理（权重系数分配）

2.3 不同样地土壤肥力与不同皂苷含有量分布特征 对10批样品中的6种皂苷数据,与其所对应的土壤肥力指标绘制折线图,分析其单一土壤肥力对重楼皂苷的影响,结果见图3。

图3表明,在pH 5左右、有机质含有量在33 g/kg、碱解氮含有量在175～180 mg/kg、速效磷含有量在50 mg/kg左右时重楼皂苷含有量最大,随着pH、有机质、碱解氮、速效磷含有量增大或减小皂苷含有量呈逐渐降低趋势；速效钾含有量在160 mg/kg左右时重楼皂苷含有量最大,随着速效钾含有量增大皂苷含有量呈逐渐降低趋势。因此采用相关性分析法,进一步验证重楼皂苷与土壤肥力的相关性。

图3 重楼皂苷含有量与土壤肥力关系

表7 灰色关联度法结果分析

2.4 皂苷含有量与土壤肥力的相关性分析 利用SPSS 21.0软件对10批样品中的6种皂苷数据,与10批样品所对应的土壤肥力指标进行相关性分析,结果见表8。

由表9显示,重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ与速效钾在0.05水平上呈显著负相关；重楼皂苷Ⅱ、纤细薯蓣皂苷与速效磷在0.01水平上呈显著正相关。表明,七叶一枝花中皂苷含有量与土壤元素中的速效磷、速效钾的含有量有直接作用,与pH、有机质、碱解氮无直接影响。其中重楼皂苷Ⅶ、Ⅰ没有体现出与土壤元素的关系,分析其原因可能是数据数量不足,有待进一步研究考证。采用逐步回归分析法,可解释以上变量与6种皂苷含有量之间的线性关系。

表8 6种甾体皂苷含有量与土壤肥力肥力指标相关性分析

2.5 逐步回归分析 根据皂苷含有量与土壤肥力指标的相关性分析结果,分别以七叶一枝花根茎中的重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、纤细薯蓣皂苷4种皂苷作因变量（Y）,以5个土壤主要化学性状pH （X1）、有机质（X2）、碱解氮（X3）、速效磷（X4）、速效钾（X5）作自变量,应用多变量逐步回归剔除对七叶一枝花活性成分含有量影响较小的因子,建立七叶一枝花活性成分含有量与主导因子的回归方程,见表9。

表9 土壤肥力指标与6种甾体皂苷含有量的逐步回归分析

结合回归方程可得,影响重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ含有量的主导因子为土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾；影响重楼皂苷Ⅱ含有量的主导因子为速效磷；影响纤细薯蓣皂苷含有量的主导因子为速效磷；影响重楼皂苷Ⅵ、Ⅰ、Ⅶ、Ⅱ总和的含有量的主导因子为速效钾；影响重楼6种皂苷总和含有量的主导因子为有机质、速效磷、速效钾。重楼皂苷Ⅱ及纤细薯蓣皂苷主导因子数目较少、决定系数r较小,影响不同成分的主导因子有所不同。

3 讨论

在课题组实际研究中发现七叶一枝花中含有的6种皂苷,与文献［19-22］相符；但偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→3）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷含有量极低,与文献［23］结果有差异,分析其原因可能与华重楼生长过程中不同生态因子有关；本研究发现多数七叶一枝花含有量要求达不到《中国药典》 规定标准0.6%；七叶一枝花质量长期不合格,重楼皂苷Ⅵ、Ⅱ、Ⅰ含有量很少甚至没有,这与《中国药典》 质量标准完全冲突,因此建议新版《中国药典》 修订七叶一枝花的质量标准。重楼皂苷H在所有样品中均检测到了,其作为七叶一枝花主要皂苷成分之一,且文献［24］表明重楼皂苷H功效为诱导血小板凝结聚集,具有止血作用,因此,建议将重楼皂苷H作为新版《中国药典》 重楼项下的七叶一枝花的质量评价标准之一。

检测的10批根茎样品,重楼皂苷Ⅶ在所有样品中均检测到,仅在样品S9、S10中检测到重楼皂苷Ⅵ,而在S9、S10样地的土壤肥力中速效钾的含有量最少,表明速效钾是影响重楼皂苷Ⅵ的重要因素；仅在样品S3中检测到重楼皂苷Ⅱ、纤细薯蓣皂苷,而在S3样地的土壤肥力中速效磷的含有量最高,表明速效磷是影响重楼皂苷Ⅱ、纤细薯蓣皂苷的重要因素。

目前灰色关联度方法已广泛应用于番茄［25］、小麦［26］、柴胡［27］、秦艽［28］、甘松［29］、黄芪［25］等质量评价方面,并且在作物与土壤施肥的相关性［26］中也有应用；逐步回归分析法也良好的运用在中药材何首乌质量评价体系中［30］。本研究联合应用灰色关联度法、相关性分析法以及回归分析法等多维统计分析对采自不同四川产地的人工栽培七叶一枝花药材质量进行综合评价分析,从综合质量评价角度提供可参考的研究模式。