严凤琴，朱 虹，吴钦钦，胡红玲，卜晓芬，明小燕，贺映侠

（华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院全科医学科，湖北武汉 430014）

心肾综合征（cardiorenal syndrome,CRS）是指心肾功能在病理生理上的紊乱,常由一个器官的急性或慢性病变导致另一个器官的急性或慢性病变的临床综合征。临床上心、肾疾病常常并存,急（慢）性心脏疾病可直接导致或加剧急（慢）性肾功能恶化,急剧肾功能下降也可增加心衰和心梗发生风险［1］。心、肾疾病共存可显著增加患者的病死率和致残率［2］。目前,如何保护和改善CRS患者的肾功能仍是一个难题。芪苈强心胶囊作为一种传统中药复方制剂,早于2004年就被我国食品药品监督管理局批准用于心衰的治疗,目前在临床上广泛应用于心血管疾病的治疗。有研究表明,芪苈强心胶囊能明显改善老年CRS患者心肾功能,并改善其临床症状［3-4］。目前,针对芪苈强心治疗CRS的机制研究还不够完善,为了进一步探讨芪苈强心改善CRS肾脏功能的作用机制,本研究拟采用左冠状动脉前降支结扎结合肾脏急性缺血再灌注损伤的方法建立CRS大鼠模型,并探讨芪苈强心对CRS大鼠肾功能改善及肾组织氧化损伤的影响,以期为其临床应用提供更充分的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验药物 芪苈强心胶囊购自于石家庄以岭药业股份有限公司（批号A1705005）,称取芪苈强心颗粒12 g,加入30 mL生理盐水溶解,配成400 g/L溶液。

1.2 动物 SPF级健康、雄性SD大鼠80只,体质量220～250 g,购自于武汉大学动物实验中心,动物生产许可证号：SCXK （鄂）2017-0018。饲养环境保持昼夜12 h光照,恒温25 ℃,空气湿度40%～70%,通风良好,自由饮食。

1.3 试剂 大鼠尿微量白蛋白（MAU）酶联免疫吸附测定试剂盒（货号E-EL-R0025c）、大鼠中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）酶联免疫吸附测定试剂盒（货号E-EL-R0662c）、大鼠胱抑素C （Cys-C）酶联免疫吸附测定试剂盒（货号E-EL-R0304c）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；肌酐 （Cre）测定试剂盒 （货号C011-2）购自南京建成生物工程研究所；逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；BCA蛋白质浓度测定试剂盒购自武汉阿斯本生物技术有限公司；NADPH氧化酶2 （NOX2）单克隆抗体 （货号ab129068）购自英国Abcam公司；GAPDH单克隆抗体（货号#2118）购自美国Cell Signaling Technology公司；HRP标记的二抗山羊抗兔IgG （货号SA00001-2）购自武汉三鹰生物技术有限公司；活性氧ROS检测荧光探针DHE （货号为活性氧ROS检测荧光探针DHE）购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 动物模型制备 采用左冠状动脉前降支结扎结合肾脏急性缺血再灌注损伤制备CRS。按40 mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,腹部备皮,碘伏消毒,正中切开,沿腹白线进入腹腔,暴露分离左右侧肾蒂,结扎阻断30 min后解除阻断,恢复血流,完成肾脏急性缺血再灌注损伤。随后沿左侧第五肋间切口,逐层切开胸腔,放置胸腔撑开器,显露心脏、剪开心包膜,在左耳与肺动脉根部之间、肺动脉根部2 mm左右,用6-0带针的手术丝线,缝扎左冠状动脉前降支。结扎后肉眼可观察到结扎处周围的心肌由红色变为苍白色,同时一定范围的结扎远端心肌活动度减弱或消失,表明心肌梗死模型建立。假手术组仅分离肌肉、血管等,不做任何缺血再灌注及结扎处理。术后腹腔滴入庆大霉素预防感染,逐层缝合关闭腹腔和胸腔,放回笼中。

1.4.2 分组及给药方法 将造模后并存活的大鼠按照体质量随机分为4组：2周模型组、2周药物组、4周模型组和4周药物组,每组10只。将存活的假手术组大鼠按照体质量随机分为2组：2周假手术组和4周假手术组,每组10只。自手术后第一天开始进行药物干预,药物组给予芪苈强心灌胃,剂量4 g/ （kg·d）,分别连续给药2周和4周。假手术组和模型组给予相同体积的生理盐水灌胃处理。

1.4.3 标本取材 （1）尿液,取材前一天将大鼠置于代谢笼单笼饲养,收取大鼠24 h尿液,3 000 r/min离心20 min,取上清-80 ℃保存待检。（2）血清,给药结束后第2天,按40 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,剖腹暴露腹主动脉并采血。全血样品于室温放置2 h或4 ℃过夜后于3 000 r/min离心20 min,取上清-80 ℃保存待检。（3）肾组织,采血后分离肾组织并剔除周围脂肪组织,生理盐水冲洗后分成两部分,一部分置于4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋保存,一部分立刻投入液氮,转入-80 ℃保存。

1.4.4 心脏超声和血流动力学检测 给药结束后第2天,按40 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,固定后采用彩色多普勒超声显像仪进行心脏超声检查,记录心电图参数：①左室舒张末期内径 （LVDd）与收缩末期内径（LVDs）；②左室射血分数（LVEF）。采用多功能电生理记录仪进行血流动力学检测,记录血流动力学参数：①主动脉收缩压 （SBP）和舒张压 （DBP）；②左室收缩末压（LVSP）和左室舒张末压（LVDP）。

1.4.5 生化指标检测 采用ELISA法检测血清中CysC和Cre。检测24 h尿液中MAU和NGAL。

1.4.6 RT-PCR检测肾脏组织NOX2 mRNA表达 取部分液氮冻存肾脏组织,用Trizol法提取总RNA,利用TaKaRa逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以逆转录的cDNA为模板,分别扩增NOX2和内参基因GAPDH。GAPDH正向引物5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′,反向引物5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′；NOX2正向引物 5′-CCCTCCTATGACTTGGAAATGG-3′,反向引物5′-AGCAAA GTAGAAAAGGGCAACC-3′。PCR条件为：95 ℃预变性1 min,94 ℃变性15 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸45 s,共40个循环,72 ℃延伸7 min。用2-△△Ct法计算NOX2/GAPDH比值,反映NOX2相对表达水平。

1.4.7 Western blot检测肾脏组织NOX2蛋白表达 取部分液氮冻存肾脏组织碾碎,提取总蛋白。使用BCA （聚氰基丙烯酸正丁酯）法测定样品蛋白浓度。取20 μg蛋白进行SDS-PAGE （十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺）凝胶电泳,然后将蛋白转移至PVDF （聚偏氟乙烯）膜上,采用5%脱脂牛奶室温封闭1 h,加入一抗anti-NOX2 antibody （1 ∶1 000）或anti-GAPDH antibody,4 ℃孵育过夜,洗涤后加入HRP （辣根过氧化物酶）标记的二抗山羊抗兔IgG （免疫球蛋白G,1 ∶10 000）室温孵育30 min,洗涤后滴加ECL （电化学发光）混合溶液到膜的蛋白面侧,暗室中曝光1 min,使用全自动数码凝胶图像分析系统拍照观察,并计算相对于GAPDH （甘油醛-3-磷酸脱氢酶）的平均吸光度值以表示NOX2蛋白相对表达水平。

1.4.8 肾脏组织ROS水平检测 取-80 ℃保存的部分肾脏组织,脱水包埋后切成厚度4 μm的切片。将活性氧ROS检测荧光探针DHE使用无菌水按照1 ∶10 000稀释,将稀释后的探针溶液滴加到组织上,以完全覆盖为宜,37 ℃孵育30 min,1×PBS洗去多余探针溶液,用抗荧光淬灭剂封片,使用荧光显微镜观察并拍照。

1.5 统计学分析方法 运用统计分析软件SPSS 19.0进行数据分析,计量数据以（）表示,两组间比较采用t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠心功能的影响 血流动力学检测结果显示,芪苈强心胶囊灌胃2周后,与2周假手术组比较,2周模型组大鼠DBP和LVESP降低（P＜0.05）,LVEDP显著升高（P＜0.01）；而与2周模型组比较,2周药物组大鼠DBP和LVESP升高 （P＜0.05）,LVEDP降低（P＜0.05）。4周后,与4周假手术组比较,4周模型组大鼠DBP和LVESP降低（P＜0.05）,LVEDP显著升高（P＜0.01）；与4周模型组比较,4周药物组大鼠DBP升高（P＜0.05）,LVEDP降低（P＜0.01）,如表1所示。心脏超声检测结果显示,芪苈强心胶囊灌胃2周后,与2周假手术组比较,2周模型组大鼠LVDd和LVDs显著升高（P＜0.05）,LVEF显著降低（P＜0.05）；与2周模型组比较,2周药物组大鼠LVDd和LVDs则又显著降低（P＜0.05）,LVEF显著身高（P＜0.05）；而4周后,4周模型组大鼠心心电图参数进一步恶化,而4周药物组则进一步改善,如表2所示。表明,芪苈强心胶囊能改善CRS模型大鼠心功能,并随治疗时间的延长而效果更显著。

表1 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠血流动力学的影响（， n=10，1 mmHg=0.133 kPa）

表1 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠血流动力学的影响（， n=10，1 mmHg=0.133 kPa）

注：与同时期模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。

表2 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠心脏超声心电图参数的影响（， n=10）

表2 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠心脏超声心电图参数的影响（， n=10）

注：与同时期模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.2 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠肾功能的影响 如表3所示,与2周假手术组比较,2周模型组大鼠血清Cys-C、Cre含有量和尿MAU、NGAL含有量均显著升高（P＜0.05,P＜0.01）；与2周模型组,2周药物组血清Cys-C、Cre含有量和尿MAU、NGAL含有量则又显著降低（P＜0.05）。4周后,4周模型组大鼠血清Cys-C、Cre含有量和尿MAU、NGAL含有量继续显著上升,而4周药物组大鼠中以上肾功能损伤指标则继续处于低水平。表明,芪苈强心胶囊可以显著改善CRS模型大鼠的肾功能。

表3 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠肾脏功能的影响（， n=10）

表3 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠肾脏功能的影响（， n=10）

注：与同时期模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

2.3 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠肾脏组织NOX2表达的影响 如表4所示,芪苈强心胶囊灌胃2周或4周后,模型组大鼠肾脏组织中NOX2 mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于同时期的假手术组（P＜0.05,P＜0.01）,而药物组NOX2 mRNA和蛋白的表达则又低于模型组（P＜0.05,P＜0.01）。说明,芪苈强心胶囊治疗可以显著抑制CRS大鼠肾脏组织NOX2表达。

2.4 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠肾脏组织ROS水平的影响 肾脏组织ROS水平检测结果如图1所示,2周模型组和4周模型组ROS水平显著高于对应的假手术组,而2周药物组和4周药物组ROS水平则显著低于同时期的模型组。表明,芪苈强心胶囊可以降低CRS模型大鼠肾脏组织的ROS水平。

3 讨论

目前,治疗CRS的方法主要集中在纠正血流动力学紊乱和肾脏的替代治疗。然而,CRS的发病机制涉及众多方面,包括血流动力学的改变、神经内分泌系统的过度活化、内皮功能障碍、氧化应激、炎症反应等［5］。芪苈强心胶囊是一种传统中药复方制剂,具有益气温阳、活血通络、利水消肿功效。有研究表明,芪苈强心可以通过抑制RAAS系统（肾素-血管紧张素-醛固酮系统）的激活、保护血管内皮功能、抑制心室重构和代谢重构来改善心、肾功能［6］。本研究通过构建心肾综合征动物模型,证实芪苈强心胶囊可以通过抑制组织氧化作用改善大鼠肾功能,对进一步完善芪苈强心疗效机制的研究具有重要意义。

表4 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠肾脏组织NOX2 mRNA和蛋白表达水平的影响（， n=10）

表4 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠肾脏组织NOX2 mRNA和蛋白表达水平的影响（， n=10）

注：与同时期模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。

图1 各组大鼠肾脏组织ROS水平（200×）

心脏左冠状动脉前降支结扎制备心肌梗死是目前用于研究心肌损伤的最常用方法,而肾脏急性缺血再灌注可导致急性肾损伤,这2种方法可模拟不同程度的心、肾功能损伤,可用于制备CRS模型［7］。本研究采用左冠状动脉前降支结扎联合肾脏急性缺血再灌注损伤的手术方法制备CRS模型,较单一手术的模型制备方法,该方法具有操作简单、手术过程可控、心肾损伤程度一致性较强等特点。采用心脏超声和血流动力学检测的方法观察模型动物心功能变化,结果显示,2周、4周后药物组大鼠血流动力学指标SBP、DBP、LVESP和LVEDP较模型组均有所改善；心脏超声结果显示,2周、4周后药物组大鼠LVDd、LVDs和LVEF较模型组也均有所改善。说明,芪苈强心胶囊可以改善CRS大鼠心功能。秘红英等［8］研究显示,经侧脑室注射芪苈强心胶囊可改善慢性心衰大鼠心功能,减轻心肌组织形态的改变。杨龙等［9］临床研究结果也显示,芪苈强心胶囊可以通过降低冠心病合并心力衰竭患者血清氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）、脂联素（APN）水平,促进患者心功能的提升。

Cre和MAU是临床检测肾损伤的金标准,但受患者年龄、性别、肌肉质量等多种因素影响并不能及时可靠的反映急性肾损伤［10］。Cys-C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂,肾小球受损时血液中含有量增高,不受肌肉质量影响；NGAL是肾小管损伤标志物,能在肾小管受损时迅速释放。两者均能更好地预测肾衰患者的肾功能恶化［11-12］。本研究联合检测血清Cre、Cys-C以及尿NGAL和MAU评估模型大鼠肾功能。结果显示,2周和4周的模型组大鼠血清Cre、Cys-C以及尿NGAL和MAU含有量显著高于同时期的假手术组,说明模型组大鼠肾功能严重受损。与模型组比较,2周和4周药物组血清Cre、Cys-C以及尿NGAL和MAU含有量则又显著降低,说明芪苈强心胶囊可以改善CRS模型大鼠肾功能。王蔚蔚等［13］在临床研究中也证实,芪苈强心胶囊也能改善慢性肾功能不全伴心力衰竭患者的肾功能。

机体内ROS积累过多或系统抗氧化能力降低,都可以导致组织脏器的病理损伤。有研究表明,在多种肾脏疾病中,氧化应激诱导的肾小管上皮细胞损伤是其病理机制之一［14］。ROS是生物有氧代谢过程中的一种副产物,主要包括超氧阴离子 （O2ˉ）、羟自由基 （·OH）、过氧化氢（H2O2）等自由基团,而机体内NADPH氧化酶（NOX）是产生ROS的主要来源。Basile等［15］研究表明,在经缺血-再灌注的大鼠肾脏中,氧化应激反应可导致肾脏血流动力学变化和纤维化,而NOX抑制剂夹竹桃麻素可以通过减轻氧化应激,从而改善肾血流量、减轻肾血管阻力、减轻肾脏纤维化。本研究结果显示,在2周和4周模型组大鼠的肾脏组织中NOX2蛋白表达水平及mRNA水平均较同期假手术组显著上升,而2周和4周药物组大鼠肾脏组织中NOX2蛋白和mRNA水平则显著低于同时期模型组。同时,组织ROS检测结果显示,2周和4周模型组大鼠的肾脏组织中ROS水平显著高于同时期假手术组,药物组则又显著低于模型组。说明,在CRS模型大鼠肾脏组织中存在较高的氧化应激水平,而芪苈强心胶囊可以通过抑制NOX2表达来抑制CRS模型大鼠肾脏组织中ROS水平。钱玉红等［16］研究也证实,芪苈强心胶囊清除氧自由基和抗脂质过氧化的功能。

综上所述,芪苈强心胶囊可抑制NOX2的表达,减低肾组织中ROS水平,改善CRS模型大鼠心、肾功能的损伤。但有关芪苈强心胶囊抑制NOX2表达的机制还需进一步研究。