张晓雪,吴孝雄(海军军医大学第三附属医院放疗科,上海 00000;上海市中医药大学附属第七人民医院肿瘤二科;通信作者,E-mail:beary999@63.com)

肝癌(liver cancer)是中国南方和东南亚常见的恶性肿瘤之一。肝癌的5年生存率低于60%[1]。病毒感染、化学致癌物质和遗传易感性可能与肝癌的发病机制有关[2]。肝癌微环境中炎性细胞大量浸润,其在肝癌细胞增殖中起重要作用[3,4]。肿瘤发病机制中的炎症作用现在已被认可,炎症以及其相应的免疫应答可能在肝癌发生和进展中扮演着重要的角色。由CD4+T细胞分泌的IL-17通过抗细胞凋亡和促血管生成机制促进肿瘤进展[5,6]。IL-17在多种人类肿瘤中的表达均有所升高[7-10]。IL-17通过影响抗肿瘤免疫反应对肿瘤的发生和发展产生影响[11,12],因此肿瘤通过抑制Th17辅助细胞进行免疫逃避[13]。微小RNA(miRNA)是一种高度保守的,内源性非编码小RNA(长度为17-25个核苷酸),其通过结合靶向mRNA的3′非翻译区(3′UTR)来抑制基因表达,诱导它们的降解或翻译抑制。研究表明,miRNA可以作为新的诊断和预后生物标志物,或癌症治疗的治疗工具[14-16]。然而,miRNA在肝癌患者中调节细胞因子的功能仍然很大程度上未定义。本研究旨在探究microRNA-135a通过靶向IL-17抑制肝癌细胞增殖的机制,为临床诊疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

筛选海军军医大学第三附属医院外科接受手术的17例肝癌患者(9例男性和8例女性)和7例正常健康受试者(5例男性和2例女性)为研究对象。纳入标准:①患者未接受过肝切除术,病灶为单发,且肿瘤直径小于10 cm;②经诊断肿瘤无肝内及远处转移且其他脏器(如心、肾等)无器质性病变。排除标准:①患者年龄大于70岁;②病灶多发或直径大于10 cm;③患者肝脏或心、肾、肺等存在器质性病变或功能较差,不能耐受手术。所有研究对象及家属均知情同意并签署参与研究的知情同意书,研究方案经我院伦理委员会批准。

1.2 细胞培养

THLE-3人肝永生化细胞系获自中国科学院(中国北京)。人永生细胞在补充有10%胎牛血清(FBS,Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Gibco)中培养,并置于5%CO2的湿润环境中培养。

从手术切除肿瘤组织中分离原代肝癌细胞,用无菌磷酸盐缓冲盐水(Gibco)洗涤肿瘤组织。将组织切成1 cm3大小并研磨,用0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸和0.2%胶原酶(Ⅱ型,溶组织梭菌)在4 ℃下消化过夜。将消化后的组织重悬于DMEM中,55 μm孔径的尼龙网过滤。过滤后的细胞进行计数,转移到含有10%FBS的DMEM中的6孔板中培养。

1.3 分组及处理

THLE-3人肝永生化细胞分为乱序对照+IL-17 MUT组、乱序对照+IL-17 WT 3′UTR组、miR-135a+IL-17 MUT组和miR-135a+IL-17 WT 3′UTR组,每组纳入10个培养皿。6孔板中培养THLE-3人肝永生化细胞融合约50%-60%时进行转染,每孔板分别加入25 pmol的含乱序对照质粒的载体和携带IL-17 MUT质粒的载体、含乱序对照质粒的载体和携带WT 3′UTR质粒的载体、含miR-135a模拟物的载体和携带IL-17 MUT质粒的载体、含miR-135a模拟物的载体和携带WT 3′UTR质粒的载体。每孔板分别加入10 μl转染试剂。以上各组模拟物类似物的浓度达到10 pmol/ml,转染后5 h进行一次换液。将细胞接种到24孔板(1.2×104细胞/孔)中并使其附着过夜。

原代肝癌细胞分为miR-135a模拟物组、空质粒转染组和乱序对照组,每组纳入10个培养皿。6孔板中培养原代肝癌细胞融合约50%-60%时进行转染,每孔板分别加入25 pmol的miR-135a模拟类似物载体、空质粒载体和乱序对照质粒载体。每孔板分别加入10 μl转染试剂。各组使模拟物类似物的浓度达到10 pmol/ml,转染后5 h进行一次换液。将细胞接种到24孔板(1.2×104细胞/孔)中并使其附着过夜。

1.4 观察指标

1.4.1 酶联免疫吸附法检测血浆IL-17的浓度 从肝癌患者和对照受试者收集血液,并通过离心分离血浆。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&D Systems)按照制造商的说明并使用Luminex 100检测系统(Life Technologies,Paisley,UK)测定血浆IL-17浓度。

1.4.2 荧光素酶报告基因测定实验 将IL-17的突变体(MUT)和野生型(WT)3′UTR亚克隆到pGL3荧光素酶载体(Promega)中。在IL-17 MUT中,缺失与miR-135a的5′序列互补的7 bp序列。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen),用miR-135a模拟物、乱序对照和携带IL-17 MUT或IL-17 WT 3′UTR的载体共转染细胞。使用双荧光素酶测定系统(Promega)测量荧光素酶的活性。

1.4.3 酶联免疫吸附法测定各转染组原代肝癌细胞中IL-17的浓度 在原代肝癌细胞转染24 h后,通过离心分离原代肝癌细胞,检测IL-17的浓度。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&D Systems)按照制造商的说明并使用Luminex 100检测系统(Life Technologies,Paisley,UK)定量IL-17浓度。

1.4.4 细胞增殖试验(MTT)检测原代肝癌细胞的增殖能力 使用3-(4,5-二甲基二唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑测定法检测细胞增殖。将各转染组的原代肝癌细胞分别接种到24孔板(1.2×104细胞/孔)中并使其附着过夜。在1,2,4,8 d后,使用MTT测定细胞活力。在分光光度计上读取每个孔在490 nm处的吸光度。一式三份进行3次独立实验。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 肝癌患者和正常人中血浆IL-17的比较

与正常受试者相比,肝癌患者的血浆IL-17浓度明显增加(P<0.001,见表1)。

表1 肝癌患者和正常受试者中血浆IL-17浓度的比较

2.2 miR-135a靶向IL-17对荧光素酶活性的影响

与含有IL-17 MUT 3′UTR的细胞中的报告基因相比,miR-135a转染后含有IL-17 WT 3′UTR的报道基因的相对荧光素酶活性降低(P<0.05,见图1)。miR-135a和IL-17 WT 3′UTR的共转染降低了WT报告基因的荧光素酶活性,但几乎不影响MUT报道基因的荧光素酶活性。

图1 各转染组荧光素酶相对活性Figure 1 The relative activity of luciferase in each transfection group

2.3 miR-135a模拟物对肝癌细胞中IL-17合成的影响

与空质粒组及乱序对照组相比,miR-135a模拟物组的转染细胞中IL-17合成减少(P<0.05,见图2)。

与空质粒组及乱序对照组相比,*P<0.05图2 miR-135a模拟物对肝癌细胞中IL-17合成的影响Figure 2 Effect of miR-135a mimic on IL-17 synthesis in hepatoma cells

2.4 miR-135a模拟物对原代肝癌细胞增殖能力的影响

与空质粒组及乱序对照组相比,miR-135a模拟物组的转染细胞增殖能力明显降低(P<0.05,见表2)。

表2 各实验组细胞的增殖能力

3 讨论

肝癌是一种与炎症密切相关的恶性肿瘤,炎症以及相应的免疫应答在其发生和进展中扮演着重要的角色。临床上迫切需要探索和阐明肝癌转移或复发的分子机制、准确预测患者预后。炎症因子在肿瘤免疫中发挥的作用取决于组织器官微环境等诸多因素,然而其机制尚未阐明。

在众多炎症因子中,IL-17参与免疫调节过程[15]。IL-17与其受体结合以触发下游信号级联,其激活炎性细胞因子/趋化因子的产生并刺激淋巴细胞的增殖和分化[17]。作为促炎细胞因子,IL-17在宿主防御、免疫监视和肿瘤生长调节中也发挥作用[18,19]。目前已经在多种恶性肿瘤中,包括卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌以及非黑素瘤皮肤癌等证实了存在IL-17表达的升高[9,18,20]。有报道指出巨噬细胞抑制因子可以通过IL-17影响肝癌细胞的存活[10]。本研究证明了肝癌患者血浆IL-17水平高于正常对照者,这说明IL-17可能与肝癌形成有关。

miRNA可能调节诱导mRNA衰变或抑制翻译的基因的表达。在IL-17信号传导途径中,已发现几种靶向信号中间体miRNA,包括miR-23a、miRNA簇106a-363、miR-181a-5p、miR-15b和miR-155[20]。本研究发现miR-135a可能靶向调节IL-17分泌,而IL-17 mRNA的3′UTR含有miR-135a的结合序列,底物与荧光素酶结合产生的荧光减少,即荧光素酶活性减低。外源miR-135a模拟物转染原代肝癌细胞中,可显著抑制肝癌细胞中IL-17的分泌,也可明显抑制肝癌细胞增殖。说明miR-135a可能靶向调节IL-17分泌,且IL-17与肝癌细胞增殖可能存在一定的联系,即miR-135a的上调可能导致IL-17的下调。因此,本研究结果示,miR135a在肝癌细胞中的上调可能导致IL-17的下调,更低水平的IL-17可能抑制肝癌细胞的增殖。

综上所述,肝癌细胞的IL-17分泌高于正常细胞,将外源miR135a模拟物转染到肝癌细胞中导致IL-17的下调和肝癌细胞增殖的抑制,即miR-135a可能通过靶向IL-17抑制肝癌细胞的增殖,miR-135a可能有机会被用作治疗肝癌的治疗策略选择之一。本研究为了解肝癌的发病机制及治疗策略提供了新的视角。