党颖慧,万陕宁,宋婷婷,郑芸芸,李 佳,杨 红(空军军医大学第一附属医院妇产科,西安 710032;通信作者,E-mail:yanghongfck@163.com)

Miller-Dieker综合征(MDS)是一种罕见的常染色体遗传病,是由位于17号染色体17p13.3区域的PAFAH1B1和/或YWHAE基因缺失或突变引起,又称17p13.3缺失综合征,它属于无脑回畸形(agyria)中一类,临床上以中枢神经系统异常包括无脑回小头畸形、胼胝体缺如或发育不良为特点,伴有特征性面容等先天性异常。作为一种严重的大脑皮层发育畸形疾病,其发病率大约为1/13 000-1/20 000[1,2]。数据库显示该区域重复的患者常见的临床表现有脑结构异常、先心病、发育迟缓、特殊面容等,是由Miller-Dieker综合征区域内的关键基因重复导致的,由于该综合征胎儿出生后预后较差,因此产前诊断该疾病显得非常重要。

本文对5例产前超声提示结构异常/血清学筛查异常的胎儿利用染色体微阵列分析技术(CMA)进行全基因组范围内微缺失/微重复的检测,评价CMA技术在产前诊断中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

孕妇1,29岁,孕28周因超声检查异常“先心病,膜周部室间隔缺损,永存左上腔静脉”行羊水穿刺。已产一男性,体健,此次为第二胎,孕妇否认近亲婚配,无家族遗传性病史及不良接触史。

孕妇2,25岁,孕30周因超声检查异常“左侧侧脑室前角旁小囊状高信号,考虑室管膜下囊肿,双侧侧脑室增宽,宽约1.2 cm,颅后窝池宽约1.3 cm”行羊水穿刺。此次为第一胎,孕妇否认近亲婚配,无家族遗传性病史及不良接触史。

孕妇3,28岁,孕24+3周超声检查正常,因唐氏筛查提示“神经管缺陷高风险”行羊水穿刺。此次为第一胎,孕妇否认近亲婚配,无家族遗传性病史及不良接触史。

孕妇4,23岁,孕26+2周因超声检查异常“先心病”行羊水穿刺。此次为第一胎,孕妇否认近亲婚配,无家族遗传性病史及不良接触史。

孕妇5,30岁,孕25+5周因超声检查异常“法洛四联症,右侧侧脑室宽1.1 cm”行羊水穿刺。此次为第二次怀孕,曾因骶尾部畸胎瘤引产一次,孕妇否认近亲婚配,无家族遗传性病史及不良接触史。

1.2 方法

1.2.1 羊膜腔穿刺 孕妇签署知情同意书后,在超声引导下经腹部行羊膜腔穿刺术,抽取羊水20 ml,其中10 ml按照常规方法进行细胞培养,另外10 ml提取基因组DNA进行CMA检测。

1.2.2 染色体核型分析 10 ml羊水离心后进行细胞培养、收获、制片及G显带分析,按常规方法进行按照人类细胞遗传学国际命名体系(ISCN)标准在油镜下分析30个分裂象,采集3-5个核型图(染色体分辨率应达到320条带水平),如果出现染色体异常/多态性时,计数50个分裂相并增加分析的核型数。

1.2.3 CMA检测 取10 ml羊水,基因组DNA提前按照试剂盒(QIAamp®DNA Blood Mini Kit)说明书操作,接着将样本DNA与750k芯片(美国Affymetrix公司Cyto ScanTM)杂交,严格按照标准操作流程:酶切—连接—扩增—纯化—片段化—标记—杂交—洗染—扫描,扫描获得的数据应用ChAS(Chrosome Analysis Suite)软件进行结果分析。

2 结果

2.1 染色体核型分析

5例羊水核型结果显示:胎儿1、3、4、5核型未见异常,胎儿2核型结果为46,XN,-17,+der(17)t(15;17)(q24.1;p13.3),胎儿2的17号染色体短臂末端有增长,其遗传自患有平衡易位父亲异常的17号染色体,17号自身短臂缺少了,而是多了15号染色体一部分(见图1)。

胎儿1,3,4,5未见异常,胎儿2的17号染色体短臂明显有增长,其遗传自父亲(平衡易位)异常的17号染色体(箭头所示)图1 5例胎儿羊水染色体G显带核型结果Figure 1 Karyotypic results of 5 fetuses by chromosome G banding

2.2 CMA检测

胎儿1结果显示17p13.3p13.2区域出现3.58 Mb的重复,胎儿2结果显示17p13.3区域发生2.15 Mb的缺失,胎儿3结果显示17p13.3区域发生1 Mb的缺失,胎儿4结果显示17p13.3区域发生1.66 Mb的缺失,胎儿5结果显示17p13.3区域发生2.52 Mb的缺失,通过ChAS软件进行结果分析,蓝色代表该区域重复,红色代表该区域缺失,结果见图2。

胎儿1为17p13.3区域的重复,箭头所指蓝色区域;胎儿2,3,4,5为17p13.3区域的缺失,箭头所指红色区域图2 5例胎儿羊水CMA检测结果Figure 2 CMA results of amniotic fluid in 5 fetuses

3 讨论

17p13.3缺失综合征(OMIM:247200)遗传学病因主要为涉及PAFAH1B1和/或YWHAE基因的染色体17p13.3区缺失/微缺失。患者的临床表现主要包括无脑回、胼胝体发育不良、脑室扩大、小头畸形、智力低下、发育迟缓、心脏畸形及异常面容(前额突出、短鼻、鼻孔上翘、上唇外凸),而数据库显示该区域重复的患者常见临床表现:脑结构异常、先心病、发育迟缓、特殊面容、智力残疾、自闭症谱系障碍等,此类特征是由Miller-Dieker综合征区域内的关键基因重复导致的[3]。本文回顾性分析了5例17p13.3微缺失/微重复综合征,旨在为此类综合征的产前诊断提供参考。

本文中5例样本检测结果大小在1-3.6 Mb之间,文献报道在这个区域有PAFAH1B1(以前是LIS1)、YWHAE和CRK基因。与MDS相关的缺失是可变的,大小从0.1 Mb到2.9 Mb不等。PAFAH1B1基因被认为是导致与该疾病相关的无脑畸形的原因,YWHAE被认为在MDS的发育迟缓和面部畸形中起一定作用,在神经元迁移中发挥重要作用,该基因的缺失可导致脑结构异常[4]。而CRK基因编码一种信号蛋白,在细胞增殖、分化、迁移和轴突生长中起关键作用,是典型的生长受限的候选基因。胎儿1和5相关区域包含3个基因:PAFAH1B1、YWHAE和CRK,而胎儿2,3,4缺失区域包含YWHAE和CRK,这些均是具有明确致病的基因。胎儿1的17p13.3p13.2区域有约3.58 Mb的重复,该重复区域包含43个OMIM基因,与OMIIM数据库中的17p13.3重复综合征(OMIM:613215)有重叠区域,数据库文献显示该区域重复的患者可能有脑异常、特殊面容、发育迟缓、先心病等临床表现[5],5位孕妇对检测结果进行遗传咨询后决定终止妊娠。

Miller-Dieker综合征与17p13.3片段缺失有关,该缺失由17号染色体发生易位或倒位所致,可通过父母平衡易位携带遗传或新发突变引起[6],研究预估约80%的病例是新发,异常中约20%遗传自父母重排染色体[7]。Chen等[8]研究29例Miller-Dieker综合征病例中产前诊断羊水染色体核型未见异常占24%,其中包含高龄及习惯性流产,而超声异常仅使用常规核型分析易导致该病漏诊,该研究表明至少45%病例与父母染色体隐匿易位或倒位有关。但几乎所有该综合征患者的染色体变异是父亲或母亲生殖细胞形成过程中的自发变异,对于曾生育过该综合征患儿的健康夫妇,再次生育此综合征患儿的概率小于1%。

染色体核型分析可准确检测染色体数目的变化和易位/倒位及大于5 Mb的结构异常,检测结果准确可靠,是目前细胞遗传学产前诊断的“金标准”,但其效率低(耗时长约15 d左右),增加孕妇等待结果的焦虑。羊水染色体核型结果提示正常是由于这些病例缺失/重复区域大小<5 Mb在镜下肉眼不能分辨,正如本文中5例羊水样本的检测结果,其中胎儿2染色体核型分析发现17号染色体短臂有增长,其父亲染色体核型为46,XY,t(15,17)(q24,p13),胎儿遗传了父亲异常的17号染色体。其他4例染色体核型未见异常,父母验证未见异常,说明染色体拷贝数变异(CNVs)是新发的。

CMA技术能够检测出常规染色体核型不能发现的染色体微缺失和微重复,从而大大提高了染色体结构异常的检出率。目前该项技术已被推荐作为不明原因生长发育迟缓、智力低下、自闭症谱系障碍以及先天性畸形患儿的一线遗传学检测技术[9-12]。在产前诊断领域该技术也被推荐为产前超声检查发现胎儿存在结构异常的一线检测方法[13,14]。文中胎儿3是由于“神经管缺陷高风险”该孕妇行羊水穿刺术选择CMA技术进行检测,结果17p13.3区域发生1 Mb的缺失。可见既往检测方法可能导致部分患病胎儿被漏诊。因此,当染色体核型结果及超声诊断结果均正常时,也不能完全排除染色体微缺失/微重复而导致的生长发育异常、先天畸形、智力低下等疾病。CMA技术能在全基因组范围内检测并精确定位染色体拷贝数变异,具有分辨率、通量及准确率均高等优点,且无需细胞培养,与传统的染色体核型分析相比,具有明显的优越性,技术平台也比较成熟,目前已被广泛应用于产前诊断领域[15]。同时CMA技术的应用极大地提高了对已知疾病的检测水平,以及对未知染色体微缺失/微重复综合征的发现,覆盖了更多的疾病,对传统的染色体核型分析也是一种补充和完善,提高了产前诊断的效率,同时也降低了胎儿出生缺陷的发生率,促进了临床诊断和遗传咨询水平的提高。