金冠钦，孙 黎，王玉洪，夏玲红，林厚文(上海交通大学医学院附属仁济医院药学部，上海 200127；通信作者,E-mail:linhouwen@renji.com)

肌苷是人体内重要物质(ATP、辅酶A、核糖核酸及脱氧核糖核酸)的组成部分之一，为嘌呤从头合成时腺苷酸和鸟苷酸的前体，在人体的物质代谢及能量代谢过程中起关键作用。肌苷作为辅酶类药物收录于2020版《中国药典》，用于白细胞减少症、血小板减少症、急性及慢性肝炎，以及肝硬化等疾病的辅助治疗。近年来，肌苷越来越多的药理作用被逐步发现，有研究显示肌苷具有修复外周组织损伤及脑损伤[3-6]、抗抑郁等作用。各种证据显示，该药在保护中枢神经系统方面具有广阔的开发前景。

不确定度分析是国际上推荐的用于定量评估检测结果的重要手段之一，用于改进实验过程的方案，提高检测质量。已有报道[9,10]使用HPLC法测定肌苷注射液含量及肌苷标准品溶液制备的不确定度评价，而使用LC-MS/MS法测定人血浆中肌苷含量的不确定度方法还尚未被报道。本研究首次根据计量技术规范《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1-2012)[11]、《测量不确定度的要求》(CNAS-CL01-G003)[12]及《医学实验室—测量不确定度的评定与表达》(CNAS-TRL-001:2012)[13]的要求，分析测定过程中不确定因素来源，计算不确定度分量，对LC-MS/MS法测定人血浆中肌苷浓度的方法进行了不确定度评价，为方法的改进提供了理论基础。

1 材料

3200QTrap质谱仪(美国AB Sciex公司)串联LC-20AD液相色谱系统(日本岛津公司)，AE240双量程(量程40 g/200 g；精度0.01 mg/0.1 mg)分析天平(美国Mettler-Toledo公司)，Eppendorf手动单道可调式移液器(德国Eppendorf公司)，Avanti30型高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司)，XW-80A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)。肌苷对照品(批号：140669-201104，中国食品药品检定研究院，纯度99.1%)，内标(IS)拉米夫定(批号：101007-200701，中国食品药品检定研究院，纯度99.7%)，质谱纯甲醇、磷酸、氨水、乙酸均购自Merck公司。

2 方法

2.1 人血浆中肌苷测定方法

2.1.1 色谱和质谱条件 色谱条件为等度洗脱，流动相为50 mmol/l乙酸铵水溶液(A) ∶甲醇(B)=1 ∶1，色谱柱为XBridgeC18柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm)，流速0.2 ml/min，柱温40 ℃，进样量10 μl，肌苷和IS的保留时间分别为1.90 min，2.02 min。

肌苷和IS采用ESI+离子化方式，离子源温度为700 ℃，离子喷雾电压为5 000 V。在MRM模式下肌苷和IS的定量离子对分别为m/z269.1→137.1，m/z230.2→112.2。去簇电压为26 V，碰撞电压为15 V。

2.1.2 对照品和内标溶液的配制 精密称量肌苷标准品(纯度99.1%)20.08 mg，用蒸馏水定容到100 ml容量瓶，振荡均匀，得肌苷贮备液199.0 μg/ml。精密称量肌苷标准品20.28 mg，用蒸馏水定容到100 ml容量瓶，振荡均匀，得201.0 μg/ml质控浓度贮备液。精密称量9.97 mg拉米夫定(纯度99.7%)，定容至500 ml，得内标物贮备液19.88 μg/ml。振荡均匀，以上三瓶贮备液，均置于-80 ℃冰箱保存备用。

吸取肌苷贮备液13 ml，使用蒸馏水定容至100 ml量瓶，得25.87 μg/ml溶液；吸取肌苷贮备液5 ml，定容至50 ml量瓶，得19.90 μg/ml溶液。再逐级稀释配制浓度为9.95,4.975,2.488,1.244,0.622,0.311,0.155,0.077 μg/ml。质量控制溶液浓度为：20.1,10.05,5.025,2.510,1.256,0.628,0.314,0.157,0.079 μg/ml。吸取拉米夫定内标贮备液5 ml，用蒸馏水定容至10 ml，得9.94 μg/ml；再取2 ml的9.94 μg/ml拉米夫定内标溶液，用蒸馏水定容至50 ml，得到397.6 ng/ml拉米夫定内标溶液。

2.1.3 血清样品前处理 250 μl含药血浆中加入内标液25 μl及250 μl的4.25%磷酸溶液，涡旋30 s，混匀后在HLB固相萃取柱上样，先后使用水1 ml及甲醇1 ml除杂，最后使用流动相溶液1 ml收集，离心(20 000 r/min)10 min，取上清液100 μl，按照“2.1.1”项下检测。

2.1.4 对照品及质控样品溶液的配制 900 μl空白血浆中分别加入各浓度的对照品溶液100 μl，后续操作同“2.1.3”。

2.2 测量不确定度分析

在分析生物样品的过程中，天平称量、标准品纯度、标准液制备、标准血浆样品的制备、血清样品前处理、标准曲线拟合、仪器允差等，均可引入测量结果的不确定[14]。测量不确定度方法有两种，包括A类不确定度评定和B类不确定度评定两类。A类评定是指用对观测列进行统计分析的方法评定标准不确定度，即测量不确定度通过标准差表示；B类评定是指用不同于测量不确定度A类评定的方法来评定标准不确定度，即测量不确定度通过一个假定的概率密度函数得到[11]。LC-MS/MS法测定人血浆中肌苷浓度的不确定度来源分析见图2。

图1 肌苷及内标物血浆样品多反应监测色谱图Figure 1 Representative multiple reaction monitoring chromatograms of inosine and IS

图2 不确定度来源分析图Figure 2 Analysis of uncertainty sources

3 结果

3.1 测量不确定度的A类评定

精密度引入的不确定度评定作为A类不确定度评定。按照“2.1.4”项下的方法制备低、中、高三个浓度(62.8，502.1，2 010 ng/ml)质控样品各3批(m=3)，每批次平行测定5次(n=5)。根据贝塞尔公式计算合并样本标准偏差：

公式中，i为组数，j为每组平行测定次数(i=3，j=5)，c为浓度水平。测定结果的标准不确定度为：

3.2 测量不确定度的B类评定

3.2.1 称量肌苷引入的测量不确定度 肌苷和内标均采用十万分之一级电子天平称量，则天平称量的合成相对标准不确定度为：

=0.204 mg

=0.025

3.2.2 样品配制引入的测量不确定度

3.2.2.5 肌苷标准血浆样品(S)和质控样品(QC)配制引入的不确定度 标准血浆样品由空白血浆900 μl及肌苷标准液100 μl涡旋混匀制成，不确定度主要由移液器引入。整个过程共使用100-1 000 μl移液器1次，10-100 μl移液器1次，其相对标准不确定度为：

3.2.3 生物样品处理过程和基质效应引入的不确定度 样品处理过程引入的不确定度，通过样品的提取回收率来体现。配制低、中、高浓度质控样品，每个浓度各5份，按“2.1.3”方法处理后进样。根据如下公式计算提取回收率及基质效应：

提取回收率及基质效应结果见表2。

表2 肌苷血浆样品提取回收率及基质效应

则低、中、高肌苷血浆样品提取回收率的相对标准不确定度为：

urel(5,M)=0.028

urel(5,H)=0.015

低、中、高肌苷血浆样品基质效应的相对标准不确定度为：

urel(6,M)=0.032

urel(6,H)=0.019

3.2.5 线性拟合过程引入的不确定度 使用肌苷峰面积与内标峰面积的比值对肌苷浓度进行线性拟合，标准曲线共包含10个浓度，权重因子为1，采用最小二乘法进行线性回归，拟合的标准曲线中肌苷与内标的峰面积比值见表3，三条标准曲线参数见表4，拟合的标准曲线反算出标准血浆样品的肌苷浓度见表5。

表3 肌苷与内标峰面积的比值

表4 线性拟合回归曲线方程

表5 标准血浆样品带入标准曲线后的肌苷浓度 (ng/ml)

自相关方差为：

残余标准差为：

=7.635 ng/ml

u(8,xM)=7.150 ng/ml

u(8,xH)=9.388 ng/ml

因此，线性拟合的相对标准测量不确定度为：

陈雷部长对此语重心长：“水利工作与民生息息相关，不能简单地把民生水利局限于某些具体工程项目上。强调民生水利，旨在树立一种发展理念，倡导一种价值取向，确立一种实践要求，实现一种目标追求。”

则：urel(8,L)=0.123

urel(8,M)=0.014 5

urel(8,H)=0.004 78

3.2.6 样品不均匀性和对照品纯度引入的不确定度 肌苷及内标均未提供不确定度，故将其引入的不确定度视为0。血浆样品经涡旋混匀、上样及过滤等过程，视为混合均匀，故样品不均匀性引入的不确定度忽略不计[17]。

3.2.7 温度引入的不确定度 肌苷对照品均按说明书要求置于105 ℃，2 h烘干后使用，实验室温度受控，未出现较大变化，故温度引入的不确定度忽略不计[18]。

3.3 标准测量不确定度的合成及扩展

LC-MS/MS测定人血浆肌苷的合成相对标准不确定度为：

据此公式计算，得肌苷低、中、高浓度质控样品的合成相对标准测量不确定度分别为：

ucrel(H)=0.091

肌苷质控样品的合成标准测量不确定度为：

则低、中、高浓度质控样品的合成标准测量不确定度分别为：ucel(L)=0.14×61.99=8.68 ng/ml，ucrel(M)=45.44 ng/ml，ucrel(H)=178.73 ng/ml。

置信概率为P=95%时(k=2)，扩展不确定度为：

U=k×ucel(QC)

则低、中、高浓度质控样品的扩展不确定度分别为17.36，90.88，357.46 ng/ml。

4 讨论

不确定度评定可查明实验过程中的误差来源及大小，评估结果的准确度，并以此提升检测质量。本文建立LC-MS/MS法测定人血浆中肌苷的浓度，并对其进行了方法学验证。通过精密度、称量、标准液的配制、标准血浆样品的配制、生物样品处理过程、基质效应及线性拟合等方面，对该方法的不确定度来源进行分析。其中，在低、中浓度样品中，线性拟合对不确定度的贡献最大，标准曲线在计算过程中，未增加权重因子进行线性拟合，所以造成低、中浓度样品偏离程度较大，而对高浓度样品的影响较小。因此，在符合检测范围的情况下，可以进行加权或者增加低、中浓度点样品的个数，提高测量结果的准确度。高浓度样品为天平称量引起的合成不确定度贡献最大。本实验使用的是十万分之一级电子天平，当对照品称量的质量较小时可引起更大的相对标准不确定度，可通过增加肌苷对照品及内标对照品的称量质量，以减少其对不确定度的贡献值。

综上所述，本研究评价了LC-MS/MS法测定人血浆中肌苷浓度的不确定度，且不确定度主要由天平称量和线性拟合引入。