黄菲?肖翠翠?王敏学?周少丽

【摘要】目的 探讨细胞缝隙连接（GJ）信号传递对肝缺血再灌注损伤（HIRI）及细胞凋亡的影响。方法 C57BL/6小鼠建立HIRI模型，随机分为假手术组（Sham组）、HIRI组、HIRI+2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2APB）组、HIRI+维甲酸（RA）组。HIRI+2APB组及HIRI+RA组在造模前腹腔注射2APB或RA。采用HE染色观察肝组织病理损伤情况，生化检测血清ALT和AST评估肝功能情况，蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bim、Bax、Caspase-3的表达，TUNEL法检测肝组织细胞凋亡情况。结果 与HIRI组相比，HIRI+RA组肝损伤及凋亡明显增加，Bim介导的凋亡蛋白表达增强（P均< 0.05）;相反，HIRI+2APB组可显著减轻肝损伤及细胞凋亡，并减少Bim介导的凋亡蛋白表达（P均< 0.05）。结论 GJ传递伤害性信号可能在HIRI进展中发挥重要作用。

【关键词】肝缺血再灌注损伤;凋亡;缝隙连接

Gap junction-mediated harmful signal transmission contributes to liver injury and cell apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion Huang Fei， Xiao Cuicui，Wang Minxue， Zhou Shaoli. Department of Anesthesiology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zhou Shaoli， E-mail： 6216833@ qq. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of gap junction （GJ）-mediated signal transmission on liver injury and cell apoptosis after hepatic ischemia reperfusion （HIRI）. Methods C57BL/6 mouse models of HIRI were established. All animals were randomly divided into the sham operation group （Sham group）， HIRI group， HIRI+2-aminoethyldiphenyl borate （2APB） group and HIRI+retinoic acid （RA） group， respectively. In the HIRI+2APB and HIRI+RA groups， the animals were intraperitoneally injected with 2APB or RA before the establishment of HIRI models. The pathological injury of liver tissues was observed by HE staining. The liver function was evaluated by biochemical detection of serum ALT and AST levels. The expression levels of apoptosis-related proteins， such as Bim， Bax and Caspase-3 in liver tissues was quantitatively measured by Western blot. The cell apoptosis of liver tissues was detected by TUNEL assay. Results Compared with the HIRI group，the liver injury induced by HIRI and the cell apoptosis were aggravated and the expression level of Bim-mediated apoptosis-related protein was remarkably up-regulated in the HIRI+RA group （all P < 0.05）. In the HIRI+2APB group， hepatic injury and cell apoptosis were significantly alleviated and the expression level of Bim-mediated apoptosis-related protein was remarkably down-regulated （all P < 0.05）. Conclusion The harmful signal transmitted by GJ may play an important role in the development of HIRI-induced liver injury.

【Key words】Hepatic ischemia reperfusion injury;Apoptosis;Gap junction

肝缺血再灌注損伤（HIRI）常见于肝移植、肝部分切除术、失血性休克等诸多过程中，可引起肝功能不全、肝衰竭甚至多器官功能衰竭。据报道，肝部分切除术后肝功能不全发生率约9.5%，是术后患者恢复延迟和死亡的主要原因[1]。HIRI机制复杂并具有多元化特点，目前尚未完全阐明。目前研究认为凋亡是肝缺血再灌注后早期肝损伤的主要形式[2]。Bcl-2家族在凋亡的调控中起着关键作用， 促凋亡蛋白Bim是近年来发现的Bcl-2家族中BH3-only亚家族的一员，也叫前凋亡蛋白，它是凋亡执行所必需的上游调节因子[3]。

细胞缝隙连接（GJ）是细胞间直接联系通道，允许分子量小于1 KDa的物质在相邻细胞间双向性流动。GJ的信号传递在维持细胞内环境稳定和器官功能、调控细胞生长发育等过程中扮演重要角色[4]。GJ介导“旁细胞效应”被很多科学家形象地将其称为“死亡之吻”，并受到了科研界的广泛关注，因为这使对继发损伤程度的限制成为可能[5]。肝细胞间的GJ十分丰富，肝细胞主要表达Cx32和少量的Cx26，GJ发挥着重要的生理功能[6]。我们团队前期体外实验发现，缺氧复氧诱导BRL-3A肝细胞凋亡与Cx32组成的GJ通讯增强有关[7]。因此我们提出假设：Cx32组成的GJ传递伤害性信号可能加重HIRI。本研究旨在初步探讨Cx32组成的GJ在HIRI中的作用，为以GJ为靶点早期干预肝损伤进展提供实验依据。

材料与方法

一、材 料

SPF级健康雄性C57BL/6小鼠28只（8 ～ 10周，20 ～ 25 g）购于广东省动物实验中心;2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2APB）及维甲酸（RA，Sigma，美国）;Bim、Bax、Caspase-3单克隆抗体（Invitrogen，美国）;HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体（Sigma，美国）;TUNEL检测试剂盒（Roche，美国）。

二、方 法

1. 70%小鼠HIRI模型

本研究中所有动物实验均通过中山大学附属第三医院实验动物伦理委员会批准。根据我们既往经验，按照我们既往发表文献[8]的方法建立小鼠70%肝缺血再灌注模型。具体操作步骤如下：①术前常规禁食8 h，自由饮水;②氯胺酮（60 mg/kg）

复合甲苯噻嗪（100 mg/kg）复合液腹腔注射进行麻醉;③手术取仰卧位，腹部备皮、消毒后腹部正中切口入腹;④进入腹腔后仔细游离进入肝左叶和肝中叶的血管;⑤使用无损伤的微血管夹阻断供应上述两个肝叶（缺血肝叶）的动脉和静脉，并保留供应肝脏尾状叶、右叶、乳头状叶及方叶的血流防止肠静脉充血;⑥缺血期间腹部伤口以湿润纱布覆盖，在进行60 min缺血后（观察缺血肝叶的颜色变化，颜色变灰白证明缺血成功），小心松开微血管夹，开始进行再灌注（再灌注后缺血肝叶颜色变化粗略判断再灌注成功）。仔细止血后，连续全层缝合腹壁切口关腹。实验过程中注意实验室的温度控制在30℃左右，并尽量减少出血。

2.实验动物分组

实验选取SPF级健康雄性野生型C57BL/6小鼠28只，随机分为假手术组（Sham组）、HIRI组、肝缺血再灌注+缝隙连接抑制劑（2APB）预处理组（HIRI+2APB组）、肝缺血再灌注+缝隙连接增强剂（RA）预处理组（HIRI+RA组）。假手术组在麻醉后只进行腹腔开腹和血管的分离，不进行肝脏的阻断和灌注。HIRI+2APB组及HIRI+RA组在造模前腹腔注射2APB（20 mg/kg，0.5 ml）或RA（10 mg/kg，0.5 ml）。

3. 标本的采集和处理

各组在肝脏再灌注后6 h采集标本。再次麻醉小鼠，并从下腔静脉取血0.5 ～ 1.0 ml，以1500转/分

的速度离心后提取上清液，分装注入已编号标记好的EP管中，置入-20℃冰箱保存，用于后续的肝功能生化检测。收集缺血肝叶，部分肝组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋、切片，HE染色，用于肝组织病理学检测;剩余肝组织放入冻存管后立即置入液氮中保存，并在实验完毕后迅速转运置入-80℃深低温冰箱进一步保存，用于后续的肝组织相关蛋白检测。

4. 肝损伤病理学评分标准

选取切片平整、组织细胞形态和结构清晰的HE染色组织切片进行光镜下观察和分析。参照Suzuki评分法对肝损伤程度进行病理学评分，具体评分标准如下：0分，无损伤， 肝实质与间质正常;1分，轻微病变，肝窦间隙轻微充血，很少空泡形成及单个肝细胞坏死;2分，肝窦间隙轻度充血，少数空泡形成，小于30%的肝细胞坏死;3 分，中度损伤，肝窦间隙中度度充血，中度空泡形成，约30% ～ 60%的肝细胞坏死;4分，严重损伤，肝窦间隙严重充血，重度空泡形成，超过60%的肝细胞坏死[9]。

5. 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达

取缺血肝叶肝组织冰浴中充分匀浆（加入裂解液），于4℃、12 000转/分离心30 min，二辛可宁酸（BCA）法蛋白定量，每份样品各取25 μg蛋白质。配胶、电泳，转膜后封闭2 h，加入β-actin（兔抗小鼠，1∶3000）、Cx32（兔抗小鼠，1∶1000）、Bim（兔抗小鼠，1∶1000）、Bcl-2（兔抗小鼠，1∶1000）、Caspase-3（兔抗小鼠，1∶1000）一抗，4℃摇床孵育过夜，磷酸盐缓冲液（PBS）洗膜3次，每次10 min。加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG  （1∶5000）  室温摇床孵育后PBS洗膜，暗室中曝光、显影，采用Image J软件检测β-actin及目的蛋白条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值作为目的蛋白表达量。将3张以上条带灰度值平均值作为本次实验结果。

6. TUNEL法检测肝组织细胞凋亡

厚度3 μm的组织切片37℃温箱烘烤过夜→脱蜡及水化→3%的双氧水甲醇溶液37℃恒温箱孵育10 min（TBS洗3次，每次5 min）→蛋白酶K渗透，37℃恒温箱孵育10 min（TBS洗3次，每次5 min）→滴加标记缓冲液，37℃恒温箱孵育2 h

（TBS 洗3次，每次5 min）→封闭液封闭，室温孵育30 min→滴加TUNEL反应液到组织上，37℃恒温箱孵育30 min（TBS洗3次，每次5 min）→滴加POD转化剂到组织上，37℃恒温箱孵育30 min（TBS洗3次，每次5 min）→DAB显色→苏木素复染细胞核90 s，充分水洗、脱水、透明及中性树脂封片→数据分析。

三、统计学处理

采用Sigmaplot 10.0分析数据。实验数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、肝损伤及评分

我们在光镜下观察肝组织HE染色切片，结果显示，假手术Sham组肝组织形态和结构基本正常，未见明显肝窦充血和肝细胞坏死;肝缺血6 h后（HIRI组）肝组织病理损伤严重，可见肝窦明显充血，肝细胞肿胀、空泡形成，炎性细胞浸润，并出现片状坏死，见图1A。各组Suzuki评分在统计学上存在差异（F = 54.33，P < 0.05）。与HIRI组相比，HIRI+RA组小鼠肝组织病理学损伤进一步加重，坏死区域面积扩大，Suzuki评分升高（P < 0.05）。相反，与HIRI组相比，HIRI+2APB组小鼠肝组织病理学损伤明显减轻，肝窦充血和肝细胞肿胀减少，坏死区域面积缩小，Suzuki评分有所降低（P < 0.05），表现出肝损伤的好转，见图1B。

二、肝功能情况

各组小鼠血清ALT和AST水平存在差异（F值分别为147.9和86.05，P 均< 0.05）。与Sham组相比，HIRI组小鼠血清ALT水平升高（P < 0.05），提示存在明显的肝细胞损伤;与HIRI组相比，HIRI+RA组小鼠血清ALT水平进一步升高（P < 0.05），提示肝细胞损伤进一步加重;相反，HIRI+2APB组ALT水平下降（P < 0.05），表现出肝功能的保护作用，见图1C。各组小鼠血清AST水平变化与ALT呈现相同的趋势，见图1D。

三、肝组织中凋亡相关蛋白Bim、Bax、Caspase-3表达

各组小鼠肝组织Bim、Bax和Caspase-3蛋白表达存在差异（F值分别为63.15、36.61和35.65，P 均< 0.05）。与Sham组相比，HIRI组小鼠肝组织Bim、Bax、Caspase-3蛋白表达上调（P 均< 0.05），与HIRI组相比，HIRI+RA组Bim、Bax和Caspase-3蛋白表达进一步上调（P均< 0.05），相反，HIRI+2APB组上述蛋白表达有所下降（P均< 0.05），见图2。

四、肝组织中细胞凋亡情况

与Sham组相比，HIRI组小鼠肝组织细胞凋亡明显增加;与HIRI组相比，HIRI+RA组细胞凋亡进一步增加;相反，HIRI+2APB组细胞凋亡明显减少，见图3。

讨论

本研究所使用的模型为70%HIRI模型，这是目前非常成熟的非致命性肝脏热缺血再灌注损伤模型，国内外大量研究均以此模型来模拟肝脏缺血再灌注过程而进行HIRI方面的研究[10]。我们团队前期研究观察了C57BL/6小鼠肝缺血1 h后不同时间点肝损伤情况的动态变化，发现再灌注6 h肝损伤最重[11]。据此，我们在本次研究中，采用肝缺血1 h再灌注6 h作为模型。

肝组织细胞中的GJ十分丰富，其中Cx32是肝脏中表达最多的Cx蛋白，占肝组织Cx蛋白总量的90%以上[12]。本研究结果显示，使用GJ增强剂可加重肝损伤及细胞凋亡，相反，使用GJ抑制剂可明显减轻肝损伤和细胞凋亡，提示在HIRI过程中，GJ可能传递伤害性信号放大损伤和凋亡。那么，究竟是哪一种Cx蛋白组成的GJ发挥的作用呢？目前認为，2APB是Cx32特异性的GJ抑制剂，只对Cx32组成的GJ功能有抑制作用，对其他Cx蛋白组成的GJ无影响，那么，我们的结果提示Cx32组成的GJ在此过程中可能发挥了重要作用[13]。

在细胞凋亡的进程中， 有两个家族的蛋白质起到非常重要的作用：Caspase家族是凋亡的执行者，而Bcl-2家族则为凋亡的决策者。Bcl-2家族又分为抗凋亡的Bcl-2亚家族及促凋亡的Bax和BH3-only亚家族。BH3-only亚家族被认为是Caspase级联反应的启动者[14]。在BH3-only亚家族成员中，Bim是目前已知最重要的促凋亡因子，因为它不仅可激活多种Bcl-2家族的促凋亡蛋白，还可与该家族中几乎所有抗凋亡蛋白结合抑制其作用[15]。有学者报道，Bim在内质网应激诱导的细胞凋亡中扮演不可或缺的哨兵角色，是上游死亡信号级联反应和下游Bax/Bak依赖的线粒体凋亡程序的连接者[16]。在造血细胞、肾脏上皮细胞、黑素细胞、神经细胞、干细胞以及自身免疫性胸腺细胞中的研究证明，Bim是凋亡最关键的始动因子，在其凋亡过程中必不可少[17-18]。本研究结果显示，通过GJ工具药改变GJ功能可以明显影响Bim及下游凋亡蛋白Bax的表达，提示GJ参与Bim介导的凋亡，但GJ究竟传递何种信号，通过何种途径促进Bim表达，还需要进一步的研究。

本实验证实了改变GJ功能可以明显影响HIRI程度和细胞凋亡数量，并改变Bim介导的凋亡相关蛋白的表达，其机制可能与GJ传递伤害性信号有关，但此伤害性信号的性质尚不清楚，值得深入研究，为以GJ为靶点，减轻HIRI提供实验依据。

参 考 文 献

[1] 彭娜，王彦峰，何维阳，李明霞，胡晓燕，叶啟发.肝移植供肝缺血再灌注损伤的研究进展.中华肝胆外科杂志，2016，22（5）：349-351.

[2] 王冰，林颖，刘慧玲，金海，汪根树，吴斌，陈规划.己酮可可碱对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响.新医学，2011，42（8）：601-604.

[3] Sionov RV， Vlahopoulos SA， Granot Z. Regulation of bim in health and disease. Oncotarget，2015，6（27）：23058-23134.

[4] Maes M， Crespo Yanguas S， Willebrords J， Cogliati B， Vinken M. Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res，2015，166（4）：332-343.

[5] Suzuki M. Significance of radiation-induced bystander effects in radiation therapy. Igaku Butsuri，2014，34（2）：70-78.

[6] Patel SJ， Milwid JM， King KR， Bohr S， Iracheta-Vellve A， Li M， Vitalo A， Parekkadan B， Jindal R， Yarmush ML. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nat Biotechnol， 2012，30（2）：179-183.

[7] Wang R， Huang F， Chen Z， Li S. Downregulation of connexin 32 attenuates hypoxia/reoxygenation injury in liver cells. J Biochem Mol Toxicol，2015，29（4）：189-197.

[8] Ge M， Yao W， Wang Y， Yuan D， Chi X， Luo G， Hei Z. Propofol alleviates liver oxidative stress via activating Nrf2 pat-hway. J Surg Res，2015，196（2）：373-381.

[9] Zhang Y， Yuan D， Yao W， Zhu Q， Liu Y， Huang F， Feng J， Chen X， Huang Y， Chi X， Hei Z. Hyperglycemia aggravates hepatic ischemia reperfusion injury by inducing chronic oxidative stress and inflammation. Oxid Med Cell Longev，2016，2016：3919627.

[10] 黑子清.肝移植围术期器官损伤机制及器官保护策略研究进展.中山大学学报（医学版），2019，40（4）：488-492.

[11] Wu S， Yao W， Chen C， Chen H， Huang F， Liu Y， Cai J， Yuan D， Hei Z. Connexin 32 deficiency protects the liver against ischemia/reperfusion injury. Eur J Pharmacol，2020，876：173056.

[12] Masia R， Diagacomo E， Adams D， King KR， Piaker S， Reinecker HC， Yarmush ML， Argemi J， Bataller R， Dienstag JL， Chung RT， Patel SJ. Hepatic gap junctions amplify alcohol liver injury by propagating cGAS-mediated IRF3 activation. Proc Natl Acad Sci USA，2020，117（21）：11667-11673.

[13] Bai D， del Corsso C， Srinivas M， Spray DC. Block of specific gap junction channel subtypes by 2-aminoethoxydiphenyl borate （2-APB）. J Pharmacol Exp Ther，2006，319（3）：1452-1458.

[14] Huang K， O'Neill KL， Li J， Zhou W， Han N， Pang X， Wu W， Struble L， Borgstahl G， Liu Z， Zhang L， Luo X. BH3-only proteins target BCL-xL/MCL-1， not BAX/BAK， to initiate apoptosis. Cell Res，2019，29（11）：942-952.

[15] Frank DO， Dengjel J， Wilfling F， Kozjak-Pavlovic V， H?cker G， Weber A. The pro-apoptotic BH3-only protein Bim interacts with components of the translocase of the outer mitochondrial membrane （TOM）. PLoS One，2015，10（4）：e0123341.

[16] Huang DC， Strasser A. BH3-Only proteins-essential initiators of apoptotic cell death. Cell，2000，103（6）：839-842.

[17] Shukla S， Saxena S， Singh BK， Kakkar P. BH3-only protein BIM： an emerging target in chemotherapy. Eur J Cell Biol，2017，96（8）：728-738.

[18] Qian G， Yao W， Zhang S， Bajpai R， Hall WD， Shanmugam M， Lonial S， Sun SY. Co-inhibition of BET and proteasome enhances ER stress and Bim-dependent apoptosis with augmented cancer therapeutic efficacy. Cancer Lett，2018，435：44-54.

（收稿日期：2020-06-18）

（本文編辑：杨江瑜）