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雷帕霉素对K562细胞增殖和凋亡作用的影响

2016-02-22黄凤霞贺红艳黄君华李小峰张淑莉

科技视界 2016年5期
关键词:增殖凋亡

黄凤霞 贺红艳 黄君华 李小峰 张淑莉 王影

【摘 要】目的:探讨雷帕霉素(RAPA)对人慢性髓系白血病K562细胞株增殖和凋亡作用的影响。方法:取对数生长期K562细胞,用不同浓度的雷帕霉素(25、50、100nmol/L)处理K562细胞24、48、72h后收集细胞,MTT比色法检测处理组细胞的生长抑制率,流式细胞术检测细胞早期凋亡率。结果:MTT法检测结果显示,与对照组相比,不同浓度的雷帕霉素对K562细胞的增殖均有明显的抑制作用,100nmol/L雷帕霉素处理72h后抑制率高达48%,且呈浓度和时间双重依赖性,与对照组相比具有统计学意义(t=6.691,p<0.05);流式细胞术检测25、50、100nmol/L雷帕霉素作用24h后,K562细胞早期凋亡率分别为13.12±0.32,18.56±0.12,25.95±0.16,均较对照组明显增高,48h、72h细胞凋亡率明显增高,两两比较差异具有统计学意义(t=4.900,t=14.640,t=16.830,p<0.05)。结论:雷帕霉素对K562细胞的生长具有抑制作用,并诱导细胞凋亡。

【关键词】雷帕霉素;K562细胞;增殖;凋亡

慢性粒细胞白血病是一种起源于造血干细胞的疾病,其特征是具有Ph染色体在分子形式形成BCR/ABL融合基因。[1]它的治疗受到科学界的广泛重视,雷帕霉素(RAPA)是一种大环内酯类抑制剂,已作为抗真菌药、免疫抑制剂应用于临床[2]。研究证实雷帕霉素具有抗肿瘤作用,如抑制骨肉瘤细胞的增殖及其血管生长[3]、诱导胰腺癌细胞的凋亡[4]等。研究报道雷帕霉素在HER2阳性的乳腺癌细胞[5]、A549肺癌细胞[6]、HepG-2肝癌细胞[7]等多种恶性肿瘤细胞中有较强的抑制作用。

有研究显示雷帕霉素抑制膀胱癌5637细胞增殖同时可以诱导细胞凋亡[8]。对于RAPA抗恶性血液肿瘤作用的机制研究报道不多。本研究以人慢性粒细胞性白血病K562细胞为研究对象,分析雷帕霉素对慢性粒细胞白血病K562细胞株的增殖及细胞凋亡的影响,为临床治疗慢性粒细胞白血病找到新方法。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人慢性髓性白血病K562细胞细胞株(陕西省人民医院血液内科中心实验室)。

1.2 主要试剂

雷帕霉素(美国LC公司)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)、噻唑蓝(MTT)购自上海生工公司、RPMI-1640(Gibco公司)、Annexin V-FITC/PI双标记染色试剂盒(晶美公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

人慢性髓性白血病K562细胞常规培养于含10g/dl胎牛血清的RPMI-1640培养液,并加入含1g/dl青霉素-链霉素,培养条件为37℃、饱和湿度为5ml/dlCO2培养箱培养,取对数生长期K562细胞进行实验。

1.3.2 MTT检测细胞增殖

将处于对数生长期的K562细胞,调整细胞密度为5×105个/ml,接种于96孔无菌培养板中,分别用25、50、100nmol/L雷帕霉素处理K562细胞,每组均设3个复孔,各组细胞置于37℃、5ml/dl CO2 培养箱培养24h、48h和72h后,然后加入10μlMTT孵育4h,将孵育后培养板取出,小心吸弃孔内上清,每孔加入150μlDMSO,于摇床上振荡10min,使结晶物充分溶解。以调零孔调零,在酶标仪上490nm波长处检测各孔吸光度值,实验重复三次,按照如下公式计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率(%)=(1-实验孔A490/对照孔A490)×100%。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率

取对数生长期K562细胞,调整细胞密度为1×106个/ml,分别用25、50、100nmol/L雷帕霉素处理K562细胞,每组均设3个复孔,各组细胞置于37℃、5ml/dlCO2培养箱培养24h、48h和72h后,4℃预冷PBS洗1次,弃上清,用100μl钙缓冲液重悬细胞,加AnnexinV-FITC10μl和PI5μl,室温孵育15min,加钙缓冲液300μl。应用流式细胞仪检测早期凋亡细胞百分率,实验重复三次。

1.3.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析,计量资料用■±S表示,均数的两两比较用t检验,p<0.05有统计意义。

2 结果

2.1 雷帕霉素抑制K562细胞增殖抑制作用:

不同浓度雷帕霉素处理K562细胞24h、48h和72h后,随着浓度的增加和时间的延长,对K562细胞抑制作用逐渐增加,细胞增殖抑制率增高,见表1。雷帕霉素对K562细胞生长有明显的抑制作用,并呈现浓度和时间双重依赖性,与对照组比较有明显差异(p<0.05)。

2.2 雷帕霉素诱导K562细胞凋亡

流式细胞仪检测结果显示,25,50,100nmol/L的雷帕霉素作用于K562细胞,作用24h,48h,72h后细胞凋亡率均较空白对照组显著增加(p<0.05),(表2)表明具有剂量依赖性,因此雷帕霉素处理组可以诱导K562细胞凋亡。

3 讨论

慢性粒细胞白血病(CML)是起源于造血干细胞的克隆性增殖性疾病,目前研究在探索治疗慢性粒细胞白血病的机制及其新方法,诱导肿瘤细胞调亡是治疗白血病的必要手段。研究表明,mTOR通路抑制剂可以使细胞周期阻滞在G1期,并可进一步促进线粒体损伤途径,产生自噬及介导细胞凋亡[9]。雷帕霉素是一种强有效的新型大环内酯类抗生素,其主要作用位点在mTOR信号传导通路,靶向mTOR信号通路是治疗肿瘤的一个新的方向,目前临床上已经应用雷帕霉素治疗肾细胞癌,在恶性血液疾病研究当中逐渐开始关注,探索雷帕霉素在慢性粒细胞白血病的作用机制,为临床治疗提供理论依据。

采用MTT法检测不同浓度雷帕霉素处理K562细胞24h、48h、72h后,对细胞生长增殖的影响,结果显示,雷帕霉素处理K562细胞增殖明显被抑制,并呈时间和剂量依赖性。增殖抑制率与对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.05),表明雷帕霉素作为mTOR的抑制剂,可以抑制K562细胞中的mTOR的活性,已有研究显示,雷帕霉素对白血病细胞HL-60、SUP-B15细胞具有较强抑制作用,因而,证实雷帕霉素抑制K562细胞的增殖,可以为慢性粒细胞白血病联合用药治疗提供新的治疗方案。

流式细胞术检测不同浓度雷帕霉素对K562细胞的早期凋亡率,结果显示,作用K562细胞24h后,早期凋亡率分别是15.19±0.32,

21.56±0.12,25.95±0.16,各实验组与对照组比较,差异具有统计学意义(p<0.05),雷帕霉素使得大量K562细胞停滞于G0/G1期,不能进入S期进行DNA的合成,抑制肿瘤细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。研究表明,雷帕霉素可通过抑制mTOR信号,从而导致造血干细胞发育分化进程被抑制,阻止细胞周期的转变[10],提示雷帕霉素明显抑制K562细胞增殖,诱导细胞凋亡,具体机制有待进一步研究。

【参考文献】

[1]G,ui XM, Zhang Y Pan JL,et al. Chronic myeloid leukemia with e14a3 BCR-ABL transcript: anslysis of characteristic and prognostic significance[J].Lurk lymphoma, 2015:56(12):3343-3347

[2]张亚莉,陈涛,王剑青,等,雷帕霉素对人急性淋巴细胞白血病细胞SUP-B15的增殖、凋亡与自噬的影响[J].实用预防医学,2012,19(9):1291-1295. Zhang YL, Chen T, Wang JQ, et al. Study on the Effects of Rapamycin on Cell Proliferation, Apoptosis and Autophagy in Human Acute Lymphoblastic Cell Line SUP-B15[J].Practical Preventive Medicine2012,19(9):1291-1295.

[3]Liu WN, Lin JH, Cheng YR, et al. FIM-A, a phosphorus-containing sirolimus,inhibits the angiogenesis and proliferation of osteosarcomas[J].Oncol Res,2013,20(7):319-326.

[4]Muilenburg D, Parsons C, Coates J, et al. Role of autophagy in apoptotic regulation by Akt in pancreatic cancer[J]. Anticancer Res, 2014, 34(2):631-637.

[5]Yan C, Wei H, Minjuan Z, et al. The mTOR inhibitor rapamycin synergizes with a fatty acid synthase inhibitor to induce cytotoxicity in ER/HER2-positive breast cancer cells[J].PLoS One, 2014,9(5):e97697.

[6]Krzesniak M, Zajkowicz A, Matuszczyk I, et al. Rapamycin prevents strong phosphorylation of p53 on serine 46 and attenuates activation of the p53 pathway in A549 lung cancer cells exposed to actinomycin D[J].Mech Ageing Dev, 2014,

139:11-21.

[7]叶献词,薛刚,束庆文,等.雷帕霉素联合顺铂诱导肝癌细胞凋亡和自噬及对细胞侵袭力的影响[J].中华临床医师杂志:2014,8(7):1293-1297.

[8]单广夷,付成,陈昂,等.雷帕霉素对膀胱癌5637细胞增殖及细胞周期的影响[J].中国医科大学学报,2015,44(3):230-233.

[9]Sun YW, Huang WJ, Hsiao CJ, et al. Methoxychalcone induces cell-cycle arrest and apoptosis in human hormone-resistant prostate cancer cells through PI 3-kinase independent inhibition of mTOR pathways[J]. Prostate,2010,70(12);1295-1306.

[10]Xiang X, Zhao J, Xu G, et al. mTOR and the differentiation of mesenchymal stem cells. Acta Biochim Biophys Sin, 2011;43(7):501-510[J].

[责任编辑:王楠]

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