张敏

[摘要]目的 探讨普伐他汀对人胰腺癌细胞SW1990的作用及其联合顺铂对该细胞增殖的影响。方法 采用MTT比色法检测普伐他汀对SW1990细胞生长的抑制作用，采用流式细胞仪测定细胞的周期分布和凋亡率。顺铂、普伐他汀联合顺铂作用细胞48 h后，采用MTT法测定各处理组的OD值，并计算相互作用指数（CI）。结果 1、5、10、15、25 μmol/L普伐他汀作用于SW1990细胞24～72 h，随着药物浓度增加和作用时间延长，处理组OD值不同程度下降（P<0.05），生长抑制率逐渐增大。0、5、15、25 μmol/L普伐他汀处理细胞48 h后，G0/G1期细胞逐渐增多，S期和G2/M期细胞逐渐减少，凋亡率由（2.74±0.92）%增加至（27.85±1.56）%。普伐他汀联合顺铂作用细胞后，两者的CI值均<1。结论 普伐他汀具有抑制胰腺癌细胞SW1990增殖和诱导该细胞凋亡的作用，并可阻滞细胞周期于G1期。普伐他汀联合顺铂对SW1990细胞具有协同抗瘤作用。

[关键词]普伐他汀；顺铂；胰腺癌；增殖；凋亡；SW1990

[中图分类号] R735.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（a）-0004-04

[Abstract]Objective To study the effects of Pravastatin on human pancreatic cancer cell SW1990 and the influence of combining Pravastatin and Cisplatin on the cells proliferation.Methods Inhibition of Pravastatin on SW1990 cells was measured by MTT colorimetric method，apoptosis rate and distribution of cell cycle were shown by flow cytometry.After the cells were treated with cisplatin，combining Pravastatin with Cisplatin for 48 hours，Proliferation was examined with MTT test，the OD values were computed，the combination index （CI） was calculated.Results SW1990 cells were treated with 1，5，10，15，25 μmol/L Pravastatin for 24 hours to 72 hours，with the increase of drug concentration and the prolongation of time，different levels of OD value in each treatment group decreased （P<0.05），the growth inhibition rate increased gradually.After the cells were treated with 0，5，15，25 μmol/L Pravastatin for 48 hours，the number of cells in G0/G1 phase increased gradually，while the number of cells in S phase and G2/M phase decreased gradually，and the apoptosis rate increased from （2.74±0.92）% to （27.85±1.56）%.The CI values of Cisplatin and Pravastatin were all less than 1 when the cells were treated with two drugs.Conclusion Pravastatin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SW1990 cells in vitro，and show an arrest of cell cycle in G1 phase.Combining Pravastatin with Cisplatin show a synergistic antitumor effect on SW1990 cells.

[Key words]Pravastatin；Cisplatin；Pancreatic cancer；Proliferation；Apoptosis；SW1990

胰腺癌預后差，在西方国家居恶性肿瘤死亡第4位，预计在未来十年内将上升至第2位[1]。在我国，胰腺癌位于恶性肿瘤死亡第9位。他汀类药物是20世纪80年代研发的一类调脂药物，可降低细胞内胆固醇生成。研究表明，他汀类药物除了具有降低胆固醇的作用外，还具有抗肿瘤作用。本研究旨在探讨普伐他汀对人胰腺癌细胞SW1990的影响及其联合顺铂的抗瘤作用。

1材料与方法

1.1主要材料

人胰腺癌细胞株SW1990由河北医科大学第四医院科研中心惠赠；普伐他汀购自美国Sigma公司；胎牛血清为杭州四季青生物技术公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司；顺铂为市售齐鲁制药公司产品。

1.2细胞培养

在37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内，将SW1990细胞置于含10%胎牛血清、含青霉素100 U/ml、含链霉素100 U/ml的RPMI-1640培养基中常规传代培养。

1.3实验方法

1.3.1 MTT比色法检测细胞增殖 将对数生长期细胞接种于96孔板，用含不同浓度普伐他汀的RPMI-1640培养基换液培养24、48、72 h。实验设空白对照组（空白培养基）、细胞对照组（不含普伐他汀）以及含1、5、10、15、25 μmol/L普伐他汀的处理组，每组设6个平行孔。培养完成后加入MTT液，继续培养4 h弃上清，上机于波长570 nm处测定吸光度（OD）值，并根据OD值计算细胞生长抑制率。生长抑制率（%）=（细胞对照组OD值-处理组OD值）/（细胞对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。

1.3.2流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率 将对数生长期细胞接种于培养瓶中，加入0、5、15、25 μmol/L的普伐他汀处理48 h后收获细胞，采用流式细胞仪对细胞进行DNA分析，计算细胞周期的时相分布和凋亡率。

1.3.3 MTT比色法检测普伐他汀联合顺铂对SW1990细胞的影响 将对数生长期的细胞制成单细胞悬液，接种于96孔板上。细胞贴壁生长后，加入含不同组别、不同浓度药物的培养基继续培养48 h，收集细胞，上机测OD值并计算不同组别细胞生长抑制率。实验分组：空白对照组，细胞对照组，浓度为0.1、0.5、1.0 μg/ml单药顺铂组，浓度为1、5、10 μmol/L普伐他汀分别联合0.1、0.5、1.0 μg/ml顺铂组。

计算普伐他汀和顺铂的相互作用指数（combination index，CI），CI值=普伐他汀a/普伐他汀b+顺铂a/顺铂b，其中，普伐他汀a、顺铂a为两药联合达到某一生长抑制率时各自的浓度，普伐他汀b、顺铂b为两药单独应用达到相同生长抑制率时的各自的浓度。CI>1.0表明两药联合具有拮抗作用，CI=1.0表明两药联合具有相加作用或无关作用，CI<1.0表明两药联合具有协同作用。

1.4统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1普伐他汀对SW1990细胞生长抑制率的影响

1、5、10、15、25 μmol/L普伐他汀处理细胞24～72 h，随着药物浓度的增加和作用时间延长，各处理组OD值不同程度下降（P<0.05），生长抑制率逐渐增高（图1）。

2.2普伐他汀对SW1990细胞周期分布的影响

5、15、25 μmol/L普伐他汀作用SW1990细胞48 h后，和对照组比较，随药物浓度增大，G0/G1细胞逐渐增多，S期和G2/M期细胞逐渐减少（图2）。

2.3普伐他汀对SW1990细胞凋亡的影响

SW1990细胞经过不同浓度普伐他汀处理48 h后，空白对照组（0 μmol/L普伐他汀）的凋亡率为（2.74±0.92）%，5 μmol/L普伐他汀处理组的凋亡率为（7.34±1.23）%，15 μmol/L普伐他汀处理组的凋亡率为（15.76±2.18）%，25 μmol/L普伐他汀处理组的凋亡率为（27.85±1.56）%。各组的凋亡率比较，差异有统计学意义（F=800.971，P<0.05）。5 μmol/L普伐他汀处理组的凋亡率高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。15、25 μmol/L普伐他汀处理组的凋亡率显著高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.4普伐他汀联合顺铂对SW1990细胞增殖的影响

采用MTT比色法分析普伐他汀联合顺铂对SW1990细胞增殖的作用，如表1所示。0.1、0.5、1.0 μg/ml顺铂作用于细胞后的OD值显著低于对照组（0 μmol/L普伐他汀+0 μg/ml顺铂），差异有统计学意义（F=311.139，P<0.05）。1、5、10 μmol/L普伐他汀分别配伍联合0.1、0.5、1.0 μg/ml顺铂，不同浓度普伐他汀联合某一浓度顺铂后，联合组的OD值显著低于该浓度单药顺铂组（0.1、0.5、1.0 μg/ml順铂组，差异有统计学意义（F=404.575、383.930、88.359，均P<0.05）。

2.5普伐他汀联合顺铂对SW1990细胞生长抑制率的影响

根据公式计算出普伐他汀联合顺铂作用SW1990细胞后的生长抑制率并绘制成抑制率曲线（图3）。结果显示，普伐他汀联合顺铂达到细胞生长抑制率为50%时的CI值，普伐他汀联合顺铂的CI值均<1，提示普伐他汀和顺铂可协同抑制SW1990细胞增殖。

3讨论

他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶阻滞内源性胆固醇合成过程中的甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）途径，从而影响许多重要的生物学功能如细胞膜构成、蛋白异戊二烯化、细胞内信号转导、细胞周期进程等[2]。越来越多的研究证实，他汀类药物对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导分化和凋亡、抑制新生血管、预防浸润转移的作用[3-8]，且其对正常细胞没有显著毒副作用，具有良好的抗肿瘤前景。本实验证明，普伐他汀对胰腺癌细胞SW1990具有抑制增殖、诱导凋亡的作用并能阻滞该细胞周期进程。

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，发病隐匿，病情进展快，患者就诊时多已发生局部浸润或远处转移，80%以上的患者已无法行根治性手术。胰腺癌致死率高，5年生存率仅为1%～4%，即使手术联合辅助化疗，总生存率也≤30%[9-10]。近年来由于治疗的进展，无法手术切除的局部晚期或转移性胰腺癌患者的总生存期已延长至将近1年[11]，但总体而言，胰腺癌患者手术治愈率低，对放疗不敏感，缺乏特异的靶点和高效的靶向药物[12-13]，新兴的免疫治疗尚不成熟[14]，化疗仍是进展期或转移性胰腺癌的主要治疗手段。顺铂为目前临床最常用的化疗药物，抗瘤谱广，顺铂联合吉西他滨是治疗胰腺癌常用的化疗方案之一。

近年来，许多体内外实验报道了他汀类药物的放化疗增敏作用。2012年的一项研究证实，在前列腺癌PC-3细胞中，阿伐他汀增强了放疗的敏感性[15]。Martirosyan等[16]指出，洛伐他汀增强了阿霉素抑制卵巢癌细胞的作用。本实验结果显示，普伐他可增强顺铂的抑瘤作用。

综上所述，普伐他汀具有抑制胰腺癌细胞SW1990增殖和诱导该细胞凋亡的作用，并可阻滞细胞周期于G1期。普伐他汀联合顺铂对SW1990细胞具有协同抗瘤作用。

[参考文献]

[1]Rahib L，Smith BD，Aizenberg R，et al.Projecting cancer incidence and deaths to 2030：the unexpected burden of thyroid，liver，and pancreas cancers in the United States[J].Cancer Res，2014，74（11）：2913-2921.

[2]Endo A.A historical perspective on the discovery of statins[J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2010，86（5）：484-493.

[3]Kotamaraju S，Williams CL，Kalyanaraman B.Statin-induced breast cancer cell death：role of inducible nitric oxide and arginase-dependent pathways[J].Cancer Res，2012，67（7）：7386-7394.

[4]Yamazaki H，Suzuki M，Aoki T，et al.Influence of 3-hy-droxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhitors on ubiquinone levels in rat skeletal muscle and heart：relationship to cytotoxicity and inhibitory activity for cholesterol synthesis in human skeletal muscle cells[J].J Atheroscler Thromb，2013，13（1）：295-307.

[5]Kah J，Wustenberg A，Keller AD，et al.Selective induction of apoptosis by HMG-GOA reductase inhibitors in hepatoma cells and dependence on p53 expression[J].Oncology，2012， 28（3）：1077-1083.

[6]Porfire A，Tomuta I，Muntean D，et al.Optimizing long-circulating liposomes for delivery of simvastatin to colon26 carcinoma cells[J].J Liposome Res，2014，25（4）：261-269.

[7]Yu X，Pan Y，Ma H，et al.Simvastatin inhibits proliferation and induces apoptosis in human lung cancer cells[J].Oncol Res，2013，20（8）：351-357.

[8]Spampanato C，Sarnataro M，Giordano E，et al.Simvastatin inhib- its cancer cell growth by inducing apoptosis correlated to activation of Bax and down-regulation of Bcl-2 gene expression[J].Int J Oncol，2012，40（4）：935-941.

[9]Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010[J].CA Cancer J Clin，2010，60（5）：227-300.

[10]Heberland J，Bertz J，Wolf U，et al.German cancer statistics 2004[J].BMC Cancer，2010，10：52.

[11]Li D，Xie K，Wolff R，et al.Pancreatic cancer[J].Lancet，2004，363（9414）：1049-1057.

[12]Rosell R，Carcereny E，Gervais R，et al.Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung caner（EURTAC）：a multicenter，open-label，randomized phase 3 trial[J].Lancet Oncol，2012， 13（3）：239-246.

[13]Zhou C，Wu YL，Chen G，et al.Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for pantients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung caner（OPTIMAL，CTONG-0802）：a multicentre，open-label，randomized，phase 3 study[J].Lancet Oncol，2011，12（8）：735-742.

[14]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

[15]He Z，Mangala LS，Theriot CA，et al.Cell killling and radio-sensitizing effects of at orvastatin in PC-3 prostate cancer cells[J].J Radiat Res，2012，53（2）：225-233.

[16]Martirosyan A，Clendening JW，Goard CA，et al.Lovastatin induces apoptosis of ovarian cancer cells and synergizes with doxorubicin：potential therapeutic relevance[J].BMC Cancer，2010，10：103.

（收稿日期：2016-10-08 本文編辑：祁海文）