彭芸

摘 要：建立了一种Captiva EMR-Lipid固相萃取柱净化，用UPLC-MS/MS法测定中15种磺胺类药残留的方法。该方法的前处理仅需进行甲酸乙腈溶液提取，离心，上清液直接通过固相萃取柱净化，浓缩，外标法测定。结果表明：该方法在10.0～100.0 ng·mL-1范围内线性关系良好，r均大于0.99，检出限为0.25 μg·kg-1，定量限为0.5 μg·kg-1;加标回收率范围在62.3%～93.4%，相对标准偏差在1.1%～7.8%。实验证明，该方法前处理较国标方法简单、快捷，可为水产品中磺胺类药物残留的快速检测提供方法依据。

关键词：磺胺类药物;固相萃取;水产品

Abstract：Using UPLC-MS/MS method to determine 15 kinds of sulfonamide residues in the method， a Captiva EMR-Lipid solid phase extraction column was established. The pretreatment of this method only needs to extract formic acid acetonitrile solution， centrifuge， and the supernatant is directly purified by solid phase extraction column， concentrated， and determined by external standard method. The results show that the linear relationship is good in the range of 10.0～100.0 ng·mL-1，

r is greater than 0.99， the detection limit is 0.25 μg·kg-1， the limit of quantification is 0.5 μg·kg-1; the recovery rate of standard addition ranges 62.3%～93.4%， and the relative standard deviation is 1.1%～7.8%. Experiments have proved that this method is simpler and faster than the national standard method， and can provide a method basis for the rapid detection of sulfa drug residues in aquatic products.

Key words：Sulfa drugs; Solid phase extraction; Aquatic products

中图分类号：TS254.7

磺胺类药物（Sulfonamides）是含有对氨基苯磺酰胺结构的一类人工合成的广谱抗菌药物，该类药物种类繁多，应用广泛[1]。磺胺类药物能抑制大多数革兰氏阳性菌和阴性菌，性质稳定且成本低。随着我国水产养殖业的快速发展，为降低水产品的发病率，提高水产品的质量方面有较明显的效果，但磺胺类药物在动物体内代谢时间较长，易造成蓄积和残留，食用含有磺胺类药物的禽畜产品会对人体造成潜在的危害，有潜在的致癌性[2-4]。

目前，国家标准和行业标准中检测磺胺类药物的方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱法、高效毛细管电泳法、酶联免疫分析法、生物传感器免疫分析法、高效液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱法、超临界流体色谱法和微生物法等[5]。其中，高效液相色谱串联质谱法具有灵敏度高、选择性强、重现性好等优势。

水产品中还有大量蛋白质、磷脂、脂溶性色素等化合物，易造成基质效应，影响分离效果，因此需对提取样品进行纯化，减少样品干扰。由于国家相关标准检测磺胺类药物的前处理方法步骤繁琐，小柱在使用之前要活化、平衡，需要一定时间，浪费溶剂，不利于快速批量检测。本次实验采用Captiva EMR-Lipid固相萃取柱净化，改进了前处理方法，优化了仪器检测条件，该方法操作简便，其基质干扰小、分析速度快，能有效地提高检测时间，且节省试剂消耗，可以作为快速筛查方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Waters Xevo TQ-S Micro三重四级杆质谱仪（配有Acquity UPLC 超高效液相色谱仪及电喷雾离子源），美国Waters公司生产;SIGMA高速冷冻离心机，美国SIGMA公司生产;Milli Q超纯水系统，美国Millipore公司生产;IKA刀式研磨仪、IKA旋转蒸发仪、涡旋振荡器，均为美国IKA公司生产;Captiva EMR-Lipid固相萃取柱，美国Agilent公司生產。

1.2 材料与试剂

15种磺胺类药物标准品：甲氧苄啶（Trimethoprim）、

磺胺吡啶（Sulfapyridine）、磺胺噻唑（Sulfathiazole）、磺胺甲嘧啶（Sulfamerazine）、磺胺?唑（Sulfamoxole）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine）、磺胺甲氧嗪（Sulfamethoxypyridazine）、磺胺甲二唑（Sulfamethizole）、磺胺对甲氧嘧啶（Sulfamethoxydiazine）、磺胺间甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）、磺胺多辛（Sulfadoxine）、磺胺甲?唑（Sulfamethoxazole）、磺胺异?唑（Sulfafurazole）、磺胺苯酰（Sulfabenzamide）、磺胺地索辛（Sulfadimethoxine），纯度≥98%，A ChemTek Inc。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵，均为色谱纯，默克公司生产。

1.3 實验方法

1.3.1 标准溶液配制

分别准确称取15种磺胺类药物标准品，用甲醇稀释，最后用相应的空白样品基质提取液制备混合标准工作液浓度为10.0、20.0、40.0、60.0 ng·mL-1和

100.0 ng·mL-1。

1.3.2 样品前处理

鱼肉组织先经研磨仪绞碎并使之均匀化，称取

5 g试样于50 mL塑料离心管中，加入2 mL水、2%甲酸乙腈4 mL，样液涡旋混匀后，9 000 r·min-1离心10 min，收集提取液，再加入5%甲酸乙腈4 mL，同上涡旋离心，合并两次提取液，取上清液3 mL直接通过不经活化的Captiva EMR-Lipid固相萃取柱，再用2 mL乙腈洗涤柱子，收集全部流出液，在40 ℃条件下旋蒸或者氮气吹至近干，用10%甲醇水溶液复溶残渣并定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤，用液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.3 仪器条件

色谱条件。色谱柱为Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱温30 ℃;流速0.25 mL·min-1;进样量2μL;流动相：A相为甲醇，B相为0.1%甲酸水溶液;梯度洗脱程序：0～1.00 min，10%A;1.01～3.00 min，10%～40%A;3.01～8.00 min，40%A;8.01～11.00 min，10%A。质谱条件。离子化模式：电喷雾离子源ESI，正离子模式;多反应监测（MRM）检测模式;毛细管电压1.0 kV;脱溶剂气温度400 ℃;脱溶剂气流量800 L·min-1。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

磺胺类药物（SAs）属于两性物质，易溶于乙腈、甲醇等有机溶剂，本实验分别比较了0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%甲酸（含5 mmo·L-1乙酸铵溶液）-乙腈、0.1% 甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸（含5 mmol·L-1乙酸铵溶液）-甲醇流动相体系梯度洗脱对15种磺胺类药物响应值和分离度的影响，结果显示，使用0.1%甲酸溶液-甲醇梯度洗脱，使各组分获得较好的分离效果，响应值最强且峰型较好。15种磺胺类药物在此条件下的多反应监测图如图1所示。

2.2 质谱条件的确定

将浓度为300 ng·mL-1的15种磺胺类药物以流动注射的方式，在正离子模式下对质谱参数毛细管电压、锥孔电压以及碰撞能量等进行调谐优化。15种磺胺类药物多反应监测质谱参数优化结果见表1。

2.3 前处理条件的优化

由于磺胺类药物很难溶于水，更易溶解于极性有机溶剂中，本实验考察了乙腈和甲醇的提取效果。相比甲醇而言，乙腈沉淀蛋白的效果较强，选择了乙腈作为提取溶剂，同时整个药物处理中具有一定的弱碱性，需要借助酸性乙腈作为样品处理溶剂，用甲酸乙腈作为提取试剂得到的色谱峰杂峰少，本实验对比了不同浓度的甲酸乙腈，单纯用2%甲酸乙腈或5%甲酸乙腈的提取效果欠佳，回收率在40%～50%。结果显示，综合2%甲酸乙腈和5%甲酸乙腈提取效果更佳，回收率也相对提高。

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性范围及检出限

本实验采用空白基质加标制备混合标准溶液的方式，称取5份5 g的阴性样品，按上述前处理方法提取得到空白基质液，分别配制成浓度为10、20、40、60 ng·mL-1和100 ng·mL-1的混合标准溶液，以待测物的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标制，建立标准工作曲线。结果表明，15种磺胺类药物在10～100 μg·L-1范围内线性关系良好，相关系数r均在0.99以上，见表2。以3倍信噪比（S/N>3）计算检出限为0.25 μg·kg-1，以10倍信噪比（S/N>10）计算定量限为0.5 μg·kg-1。

2.4.2 回收率和精密度

本实验采用以未检出待测组分的样品做添加回收实验，来验证方法的准确性，在鱼肉空白样品中分别添加不同量的混合标准溶液（添加水平分别为8、10、16 μg·kg-1），每个浓度设6个平行样，按上述优化的实验方法测定各种磺胺类药物的平均回收率在62.3%～93.4%，相对标准偏差（RSD）在1.1%～7.8%，满足GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》的要求。实验结果见表3。

3 结论

本文采用甲酸乙腈提取，CaptivaEMR-Lipid固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了水产品中15种磺胺类药物残留的检测方法。结果表明，该前处理方法快速方便，净化步骤使得基质干扰小，本方法线性、回收率、精密度均满足检测要求，可用于水产品质量安全监测时大批量样品中磺胺药物的快速筛查。

参考文献：

[1]何世超，Jeyakkumar P，Rao A S，等.磺胺类药物化学研究新进展[J].中国科学（化学），2016，46（9）：823-847.

[2]于淼.养殖业中磺胺类药物残留的危害及现状[J].现代畜牧科技，2015（2）：133-135.

[3]Baynes R E，Dedonder K，Kissell L，et al.

Health concerns and management of select veterinary drug residues[J].Food Chem Toxicol，2016，88：112-122.

[4]刘健华，陈杖榴.动物性食品中兽药残留对人体肠道菌群的影响及其研究模型与方法[J].动物医学进展，2003，24（2）：37-48.

[5]段振娟，张鸿雁，王硕.动物性食品中磺胺类药物残留分析研究进展[J].食品研究与开发，2007，28（6）：149-152.