通痹颗粒对类风湿关节炎继发肺间质病变模型大鼠的保护作用

2020-11-02姚璐莎王雁芳范伏元

世界中医药 2020年12期

姚璐莎王雁芳范伏元

摘要目的：觀察通痹颗粒对类风湿关节炎继发肺间质病变模型大鼠的保护作用，探讨通痹颗粒是否是通过阻断经典Wnt信号传导通路来多方位调节机体免疫系统从而保护肺脏。方法：60只SD大鼠随机分为通痹颗粒组、硫唑嘌呤组和模型组（MC）、正常组（NC），正常对照组除外，其余各组采用牛Ⅱ型胶原联合博莱霉素诱导的类风湿关节炎继发肺间质病变模型，分别于造模成功后7 d、14 d和28 d 3个时间点观察关节炎指数。28 d时处死大鼠，测定血清中TNF-α的含量、观察肺组织切片病理变化。结果：实验阶段通痹颗粒组大鼠关节炎指数评分由开始时的8.25分最终下降到5.12分，与模型组比较，3个观察时间点关节炎指数得分均低于模型组，差异均有统计学意义（均P<0.05）;28 d时与模型组比较，通痹颗粒组大鼠血清TNF-α水平（122.59 pg/mL）低于模型组（179.87 pg/mL），差异有统计学意义（P<0.01），与正常组相当（P>0.05）;HE及Masson染色观察RA-ILD大鼠肺间质组织形态学显示，模型组大鼠肺间质形态明显改变，通痹颗粒与正常组形态接近。结论：通痹颗粒对牛Ⅱ型胶原联合博莱霉素诱导的类风湿关节炎继发肺间质病变具有明显保护作用。

关键词类风湿关节炎;肺间质病变;SD大鼠;通痹颗粒;益气通络;炎性反应;病理变化;保护作用

Abstract Objective：To observe the protective effect of Tongbi Granule on rats with pulmonary interstitial disease secondary to rheumatoid arthritis， and to investigate whether Tongbi Granules protect the lungs by blocking the classical Wnt signaling pathway and regulating the body′s immune system in multiple directions.Methods：A total of 60 SD rats were randomly divided into normal group（NC），Tongbi Granule group，Azathioprine group and model group （MC）. Bovine type II collagen combined with Bleomycin were used in the other groups to induce pulmonary interstitial disease secondary to rheumatoid arthritis model ，except the normal control group .The arthritis index was observed at three time points：7 d，14 d and 28 d after successful modeling. At 28 days， the rats were sacrificed， the content of TNF-α in serum was measured， and the pathological changes of lung tissue sections were observed. Results：In the experimental stage， the arthritis index score of the Tongbi Granule group was finally reduced from 8.25 at the beginning to 5.12.Compared with the model group， the arthritis index scores of the three observation time points were lower （all p<0.05）. After 28 days， compared with the model group， the serum TNF-α level （122.59 pg/mL） in the Tongbi Granule group was lower than that in the model group （179.87 pg/mL）（P<0.01）. HE and Masson staining observation of lung interstitial tissue morphology of RA-ILD rats showed that the lung interstitial morphology of model rats was significantly changed， and the Tongbi G ranules group was close to the normal group.Conclusion：Tongbi Granule has obvious protective effect on pulmonary interstitial lesions induced by bovine type Ⅱ collagen combined with bleomycin.

Keywords Rheumatoid arthritis; Pulmonary interstitial lesion model; SD Rats; Tongbi Granules; Benefiting qi and unblocking collterals; Inflammatory response; Pathological changes; Protective effect

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.014

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是以关节组织慢性炎性反应为主要表现的自身免疫病，主要累及周围关节，表现为慢性、多发性、对称性关节肿胀疼痛[1]。肺间质病变（Inierstitial Lung Disease，ILD）是其常见的并发症，是类风湿关节炎最常见的死亡原因之一[2]。一般认为由于免疫系统紊乱导致巨噬细胞和淋巴细胞活化，从而释放多种细胞因子造成肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞间基底膜的损伤、异常纤维母细胞增生[3]，炎性反应及细胞外基质成分的沉积等，是一个多因素、多个环节参与的缓慢的错综复杂的过程[4]。通痹颗粒具有益气通络的作用，其主要组成为黄芪、当归、血竭等，在临床和实验中具有很好的疗效[5]。RA的肺病变的研究尤为重要。因此，本实验通过复制类风湿关节炎继发ILD模型[6]，观察RA大鼠肺组织切片HE和Masson染色及血清TNF-α水平变化，分析通痹颗粒对肺病变是否具有保护作用，探讨通痹颗粒治疗RA合并ILD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只鼠龄5～6个月龄、体质量（200±10）g的雌性SPF级SD大鼠，由湖南中医药大学提供。动物合格证号：SYXK（湘）2015-0003。随机分为正常组、通痹颗粒组、硫唑嘌呤组和模型组各15只，标准饲养，实验前饲养7 d，灯光照射12 h，并予严格的卡片登记管理，观察无异常者入组实验。

1.1.2 药物硫唑嘌呤[7]（Azathio Prine Tablets，AZP）（上海信谊药厂有限公司，批号：CAS：446-86-6），2.5 mg/片，来自;通痹颗粒生产于湖南中医药大学第一附属医院自制药，先取通痹颗粒6 g，用10 mL无菌生理盐水溶解，摇匀，制成0.6 g/mL药液，放至4 ℃冰箱中保存备用。

1.1.3 试剂牛II型胶原冻干口服剂[8]购自北京博蕾德生物科技有限公司，货号：20021;博莱霉素购自天津太河制药有限公司，批号：Z8020（1.25 mL）;不完全弗氏佐剂和冰醋酸：由湖南中医药大学病理教研室惠赠。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 60只SD大鼠，正常组、通痹颗粒组、硫唑嘌呤组和模型组均按完全随机方法分组。正常组正常饮水摄食，不作任何处理，其余组均通过牛Ⅱ型胶原联合博莱霉素制备RA-ILD模型。造模方法包括：充分溶解牛II型胶原冻干，与不完全弗氏佐剂等体积混合、振荡乳化，制成牛Ⅱ型胶原，浓度为2 mg/mL。将SD大鼠尾根部5个部位进行皮内注射，总量0.3 mg。初次免疫2周后同前法进行2次免疫，总量0.3 mg[9]。于首次注射牛Ⅱ型胶原乳剂后18天进行评判。保证注射前后单侧左足踝隆起的体积>1.6 mL，关节炎指数评分>4分。麻醉大鼠后将其仰卧固定于大鼠实验台上，无菌条件下做颈部正中切口，充分暴露气管，注射器经气管软骨环朝向心端缓慢注入博莱霉素注射液，剂量为5 mg/（kg·BW），注药后继续注入0.3 mL空气[10]，药液充分注入肺内，将动物直立并旋转，之后缝合皮肤。

1.2.2 给药方法模型制备完成后，对通痹颗粒组、硫唑嘌呤组和MC组大鼠进行灌胃治疗。MC组大鼠灌胃生理盐水;硫唑嘌呤组大鼠灌胃硫唑嘌呤药液，将硫唑嘌呤片研成细末，加生理盐水，配置比（每1 mL含硫唑嘌呤2.5 mg），按2.5 mg/（kg·d）的剂量灌胃，1次/周;通痹颗粒组灌胃通痹颗粒药液（0.3 g/只·d），灌胃2次/d，时间分别为9：00和15：00，直到处死为止。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 大鼠关节炎指数 Wood氏的评估标准[11]，作关节炎指数评分并记录。4只足爪分别记录，最高分16分。模型组评分与正常组评分比较经统计学检验差异有统计学意义，作为模型制备成功的依据。

1.2.3.2 ELISA法检测血清TNF-α水平末次给药结束，处死禁食12 h大鼠。麻醉大鼠，分离腹主动脉采血，离心机离心半径0.8 cm，3 000 r/min，离心5 min，吸取上清，置-20 ℃保存待测，采用ELISA法检测血清TNF-α值。

1.2.3.3 肺组织形态学观察腹主动脉取血后，快速取出右中肺，固定、脱水透明、浸蜡、包埋、切片、制片。脱水后采用HE染色、肺组织切片Masson染色，光学显微镜下明确肺组织情况、检测肺间质中胶原蛋白沉积情况。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，2组间比较用t检验，多组计量资料用方差分析比较，两两比较用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理组SD大鼠关节炎指数评分正常组大鼠无关节无红肿;给药前与正常组比较，模型组大鼠关节炎指数（8.02分）明显高于正常组（0.00分）（P<0.01），说明造模成功;与模型组比较，通痹颗粒组大鼠关节炎指数积分在给药7 d（7.45分）、14 d（6.56分）、28 d（5.12分）均低于模型組（P<0.05）。给药28 d后，通痹颗粒组大鼠关节炎指数（5.12分）低于硫唑嘌呤组（5.92分）（P<0.05）。见表1。

2.2 不同处理组RA大鼠血清TNF-α水平情况 28 d后4组大鼠血清TNF-α水平组间比较（P<0.01）;与模型组（179.87 pg/mL）比较，正常组血清TNF-α含量较低（121.63 pg/mL）（P<0.05）。与正常组比较，通痹颗粒组SD大鼠血清TNF-α水平（122.59 pg/mL）与之相当，差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较，通痹颗粒组血清TNF-α水平显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 各组RA模型大鼠肺组织病理变化 1）HE染色：光镜下，正常组大鼠肺泡上皮细胞及肺泡壁无明显病变，余各组大鼠灌胃第2周开始出现散在的气管周围炎性反应细胞浸润，肺泡壁炎性水肿、间隙增宽，病变程度随着时间的延长而增加。模型组肺间质细胞大量增生，上皮增生，肺泡壁增厚，硫唑嘌呤组及通痹颗粒组间质轻度增生，腺泡大小不等，部分已破坏、消失，轻度淋巴细胞浸润，为淋巴网状细胞取代。见图1。2）Masson染色：光镜下，模型组肺胶原组织增生、肺泡壁塌陷，伴大量的胶原纤维增生;硫唑嘌呤组部分小管间质纤维化，间质纤维增生呈局灶性;正常组肺间质无增生、肺泡壁正常;通痹颗粒组部分肺泡壁塌陷，胶原纤维增生呈局灶性;通痹颗粒组、硫唑嘌呤组与模型组比较，间质纤维化程度相对较轻。见图2。

3 讨论

类风湿关节炎是常见的自身免疫性疾病[13]，临床表现多样，是我国人群丧失劳动力和致残的主要原因之一，且该疾病内脏受累十分常见，研究显示，ILD是其常见的并发症。对于此类患者，现仍缺乏规范的治疗方案，疾病加重，很多药物治疗无效，致残率致死率很高。因此，中医药治疗本病日益受到临床研究者及病患们的重视。

类风湿关节炎合并ILD多“虚”“瘀”“痰”，并基于“益气通络”理论研制出通痹颗粒，其在理论基础上多方位起到调节机体内环境的作用。研究显示，通痹颗粒合甲氨喋呤能够显著降低类风湿性关节炎患者血清VEGF及血清IL-6水平[14]，且起到平衡虚实、扶正驱邪，使经络恢复通畅，肺脏体用得以恢复，符合《素问》所提出的“血实宜决之，气虚宜掣引之[15]。

血清TNF-α水平升高与RA密切相关，且实验显示患者血清TNF-α水平[12]可反映RA患者疾病的活跃程度。本次实验表明，血清TNF-α水平高，提示机体炎性反应活动度较高并与关节肿胀积分呈正相关;HE及Masson染色通过肺组织肺泡壁炎性水肿、肺上皮纤维增生变化，反映肺组织受累情况。由此可见，RA患者本身炎性反应因子增加，免疫复合物沉积于机体内，导致关节滑膜炎性表现，继而出现关节肿胀。同时，由于炎性因子刺激自身免疫系统，导致自身免疫耐受下降，免疫网络系统失衡，气管及支气管上皮炎性反应细胞浸润，进而引起肺组织损害，最终肺功能受到影响。

本研究通过评估大鼠关节炎指数、观察肺组织病理变化、检测血清TNF-α水平显示：经药物干预后，通痹颗粒组RA-ILD模型大鼠关节炎指数评分明显降低，血清TNF-α水平明显降低，病理形态学提示肺组织炎性水肿、纤维增生有所改善。可见通痹颗粒对于ILD模型大鼠具有一定保护作用，可能与其抑制上皮-间充质细胞转化，降低免疫炎性反应，保护肺系统，延缓并治疗肺间质纤维化，进而发挥调节机体免疫平衡，实现内环境稳态的治疗效果有关。本研究也为类风湿关节炎继发ILD的中药治疗提供了新思路。

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