刘英琦　曹莫　任志鑫

[摘要]目的：探讨微等离子体与点阵Er：YAG激光（2940nm）对兔耳增生性瘢痕的治疗效果。方法：同种属雌性新西兰大耳白兔6只，于每只兔耳腹侧面中段制作增生性瘢痕模型。28d后，将造模成功的瘢痕块随机分为3组，分别行微等离子体、点阵激光治疗和空白对照，治疗后27d取材，进行HE、Masson和天狼猩红染色，观察各组瘢痕组织中成纤维细胞数目、胶原分布特征及Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的构成比。结果：两个治疗组瘢痕组织变软变平且弹性增加，成纤维细胞数均较对照组减少，以Plasma组更为明显；胶原纤维的形态及排列向正常皮肤中的形态及排列转变，Ⅲ型胶原纤维的比例均增加，两治疗组间无显著差异。结论：微等离子体与点阵Er：YAG激光（2940nm）治疗兔耳增生性瘢痕均有效，且在抑制瘢痕组织内成纤维细胞增生方面，微等离子体具有更明显的优势。

[关键词]激光；瘢痕；成纤维细胞；胶原；兔；微等离子体

[中图分类号]R619⁺.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0066-04

成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过度沉积是增生性瘢痕的病理学基础。干预成纤维细胞的生物学活动，改变细胞外基质的主要成分：Ⅰ、Ⅲ型胶原的排列形态，可治疗增生性瘢痕。点阵Er：YAG激光（2 940nm）目前己在治疗凹陷性瘢痕方面取得了良好疗效。微等离子体射频技术也已成功用于细小皱纹、妊娠及凹陷性瘢痕的治疗，且已证实二者在刺激胶原蛋白再生及改善胶原纤维排列方面疗效突出。因此，我们采用微等离子与点阵Er：YAG激光治疗兔耳增生性瘢痕，通过观察各组兔耳增生性瘢痕的病理组织切片中成纤维细胞数目、胶原纤维排布特征，以及Ⅰ、Ⅲ型胶原构成比例的变化来探讨其对增生性瘢痕的治疗是否有效，并比较二者的疗效。

1资料和方法

1.1实验动物和设备：同种属新西兰大白兔6只，雌性，体重（2.5±0.20）kg，采購于河北医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（冀）2008-2-001。实验设备：①Plasma微等离子射频仪（Alma Lasers，Israel）；②点阵Er：WAG激光（2 940hm）：（Asclepion MCL30 Dermablate，German）；③偏光显微镜，（Olympus，Japan）；④实验试剂：天狼猩红（Sigma，America）。

1.2动物模型制作：参照李荟元等动物增生性瘢痕模型的制作方法，速眠新、氯胺酮以1：1的比例混合后按0.2ml/kg肌注，全麻。于每只兔耳腹侧面中段，用圆形环钻沿长轴避开血管，各做4个直径为8mm的圆形全层皮肤缺损创面，并刮除软骨膜，共形成48个圆形创面（图1）。创面1周左右上皮化后，去除痂皮，造模术后28d左右达到增生高峰，瘢痕块颜色发红、质硬、明显突起于周围皮肤，但未超出原术野范围（图2a-a，2b-b）。随机切取部分瘢痕组织，HE染色可见过度增殖的成纤维细胞、微血管、胶原纤维，认为造模成功。

1.3实验过程：造模术后28d，共形成增生性瘢痕42处，随机分为3组：①Plasma治疗组：无套管治疗头，0.6ms，80w，1遍；②点阵Er：WAG激光（2 940hm）治疗组：微孔点阵模式，光斑13mm×13mm，分9层打孔，能量密度162J-/em²。③空白对照组：不做治疗。治疗后创面表面外涂红霉素眼膏，继续分笼避光饲养，未见水疱、紫癜及血疱等，恢复过程中未见感染。

1.4观察和测量：造模术后55d，观察并记录各组兔耳创面愈合、瘢痕增生情况及经治疗后瘢痕颜色、质地、厚度变化。麻醉成功后，11号尖刀切取兔耳增生性瘢痕组织对应的全层兔耳，即刻放入中性福尔马林缓冲固定液中，并分组标记。4℃固定2周后，以全层兔耳为断面，纵向截取瘢痕标本，梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。①HE染色：在400倍普通光学显微镜下观察兔耳增生性瘢痕组织的特征性结构；每张兔耳瘢痕组织切片中央及两侧各随机选取2个不重叠视野，分别记录镜下目测到的成纤维细胞数目；②Masson染色：400倍普通光学显微镜下观察兔耳增生性瘢痕组织中胶原纤维形状，密度以及排列走向情况；③天狼猩红染色：将空白切片置于1%饱和苦味酸天狼星红溶液染色1h，流水冲洗5min。苏木精复染2min，常规分化返蓝，流水冲洗，常规脱水，透明，封片。在400倍偏振光显微镜下观察，Ⅰ型胶原纤维为粗大明亮且不均匀的红色或黄色纤维，显示很强的双折光性，排列密集无序；Ⅲ型胶原纤维为纤细的绿色纤维，显示弱的双折光性，呈疏网状分布于Ⅰ型胶原纤维周围，摄片，麦克奥迪数码医学图像分析：以绿色纤维代表Ⅲ型胶原纤维，分析出图像中绿色纤维的阳性总面积；以黄色和红色纤维代Ⅰ型胶原纤维，分析出图像中红色黄色纤维的阳性总面积。将Ⅲ型胶原纤维的阳性总面积除以Ⅰ型胶原纤维的阳性总面积，计算出Ⅲ型胶原纤维比例。

1.5统计学处理：统计各实验组兔耳增生性瘢痕组织中不同视野下单位面积内成纤维细胞数目，Ⅲ型胶原所占比例，数据用均数±标准差表示。应用SPSS13.0软件进行完全随机分组的方差分析，以P<0.05作为判断差异显著性的标准。

2结果

2.1大体观察：对照组：瘢痕组织色红、质硬，突起于皮肤表面，但未超出原手术范围；Plasma治疗组：治疗后即刻可见瘢痕组织表面均匀分布的焦黄色点状微孔、少量点状渗血及淡黄色渗液。创面自行结痂，10d左右完全脱落。取材前可观察到瘢痕颜色变浅、质地更接近周围正常皮肤（图2a、2b）。点阵Er-YAG激光治疗组：治疗后即刻可见均匀分布的白色至微黄的针尖状气化孔，无明显渗出。痂皮较薄，一周左右自行脱落。至取材前可见瘢痕组织体积缩小，颜色较对照组变淡，质地平软，弹性增加（图2b-a）。

2.2病理染色结果

2.2.1 HE染色：对照组：成纤维细胞大量增生且排列无序，微血管增生明显（图3a），成纤维细胞数（77.14±9.304）个/视野；Plasma治疗组：成纤维细胞增生受抑，数目减少（图3b），（59.12±10.344）个/视野；点阵激光治疗组：成纤维数目变少，排列有序（图3c），（66.00±7.943）个/视野。经统计，3组标本镜下单位面积成纤维细胞数目有统计学差异（P=48.324，P=0.000<0.01）；SNK法多重比较结果显示，三组标本中任意两组之间总体均数差异均具有统计学意义（均P<0.05），微等离子组较点阵激光组成纤维细胞数减少更为明显。

2.2.2 Masson染色结果：对照组胶原纤维大量增生，形状粗大且排布紊乱，可见旋涡结构（图4a）。两治疗组胶原纤维变细长且较对照组排列疏散并趋于一致（图4b、4c）。

2 2.3偏光显微镜观察与图象分析：对照组瘢痕组织中，胶原纤维分布密集且无序，黄色粗大的Ⅰ型胶原纤维呈丛束状分布，排列无序，粗细不均，约占整个视野的59.2%，呈细丝状绿色的Ⅲ型胶原纤维呈网疏状分布于Ⅰ型胶原周围，约占（40.8±4.13）%（图5a）；微等离子组：胶原纤维排列较对照组有序，且方向趋于一致，Ⅲ型胶原比例增加，约占（45.9±3.07）%（图5b）。点阵激光组，胶原纤维分布疏散，排布渐规则，Ⅲ型胶原比例较对照组亦明显增加，约占（44.4±3.06）%（图5c）。不同处理组的兔耳增生性瘢痕组织中Ⅲ型胶原所占比例有统计学差异（F=5.745，P=0.008）；SNK法多重比较结果显示，除了微等离子组与点阵激光组之间总体均数差异没有统计学意义外，其余任两组总体均数差异均有统计学意义（均P<0.05），可认为微等离子与点阵激光均能使兔耳瘢痕组织中Ⅲ型胶原比例增加，但二者无明显区别。

3讨论

增生性瘢痕形成的实质是成纤维细胞的过度增殖，胶原蛋白的过度合成大大超过其分解代谢的速度，导致细胞外基质的过度沉积。作为细胞外间质的主要成分，Ⅰ、Ⅲ型胶原起着最为重要的支撑作用。Ⅰ型胶原是早期创面瘢痕愈合的基础，占据着整个瘢痕组织，抗张力性很强，决定了组织僵硬度。Ⅲ型胶原是正常皮肤组织中网状纤维的主要组成成分，较前者伸展性和柔软度好，决定组织的弹性。

瘢痕增生的早期即可观察到组织内胶原含量、比例及结构的改变，临床针对胶原的治疗可明显改善瘢痕质地，因此通过干预胶原增生及排布情况来控制瘢痕增生的方法是科学可行的。

近年来激光医学及射频技术以其安全性高、创伤小的优势成为治疗病理性瘢痕的新技术。本实验将微等离子体与点阵Er：YAG激光（2940nm）可影响组织胶原的发生与发展这一特性运用于增生性瘢痕的早期干预，即在早期就开始诱导其胶原的含量及形态向正常组织转化，以进一步改善预后，探讨疗效是否确切并进行对比，为临床射频技术和点阵激光治疗增生性瘢痕提供理论依据。

微等离子是一项临床治疗瘢痕的新技术，它对成熟凹陷性瘢痕的疗效已得到肯定，其单极射频治疗头在即将接触皮肤时利用射频能量将空气中氮气分子，迅速解离成高能量的第四态物质发射出来，即等离子体，引起表皮至真皮浅层的点状微剥并形成阵列样排列的“热修正區”，促使胶原新生及重排，以填平皮肤表面的细纹及凹陷。微等离子作用于皮肤后不会引起表皮的完全气化，而是形成点状痂皮，直到皮肤组织完全修复才脱落，减少了创面感染、色素沉着的发生率。陆雯丽等发现经微等离子治疗后患处水肿程度较轻，结痂时间及红斑期较短，大大减少患者的停工时间，大量临床实验均证明了微等离子体射频技术对各类原因导致的瘢痕的有效性，是治疗瘢痕的一项安全且疗效理想的技术。

点阵激光首先在治疗萎缩性瘢痕方面取得了良好的疗效，其原理为点阵式光热作用：组织中水分子吸收能量后，产生矩阵状排列的微热损伤区，使周围组织发生创伤愈合反应来刺激真皮胶原再生、重构，使治疗区瘢痕更接近正常组织。点阵激光能精准地汽化所到层次以上的皮肤，凝固层较薄，皮肤更快修复，术中痛感较微针等其他治疗方法轻微，术后炎症反应轻、色素沉着发生率低，故更能被大众所接受。但目前尚缺少治疗增生性瘢痕方面的详细报道。

本实验证实，这两种治疗方法与对照组比较，均能提高兔耳增生性瘢痕中Ⅲ型胶原比例，改善胶原排列，并抑制成纤维细胞增生。两种治疗方法对比，微等离子治疗后的兔耳增生性瘢痕内成纤维细胞数减少较点阵组更为明显，在提高Ⅲ型胶原比例方面两治疗组无明显区别，这一结果为临床Plasma治疗增生性瘢痕提供了基础理论证据。