杨芊芊 高歌 王瀚泽

摘要 目的：研究牛膝不同提取分离部位对体外培养的神经干细胞增殖的作用。方法：采用系统溶剂法以及柱色谱法将牛膝分成不同部位，以CCK-8法检测牛膝各部位对体外培养的神经干细胞增殖的效果，并筛选出较好的作用部位和浓度。结果：牛膝正丁醇部位（25 μg/mL，P<0.01）和其多糖部位（12.5 μg/mL，P<0.01）对神经干细胞增殖活性有明显促进作用。结论：牛膝正丁醇部位和多糖部位可能是其促神经干细胞增殖的主要活性部位。

关键词 牛膝;神经干细胞;增殖;活性部位筛选

Abstract Objective：To study the effects of different extracted parts of twotoothed achyranthes root on the proliferation of neural stem cells cultured in vitro. Methods：The systemic solvent method and column chromatography were used to separate the twotoothed achyranthes root into different parts. The effects of various parts of twotoothed achyranthes root on the proliferation of neural stem cells were detected by CCK-8 method， and the optimal parts and concentration was screened. Results：The n-butanol part（25 μg/mL，P<0.01）and the polysaccharide part（12.5 μg/mL， P<0.01）significantly promoted the proliferation of neural stem cells. Conclusion：The n-butanol and polysaccharide part of twotoothed achyranthes root may be the main part for promoting the proliferation of neural stem cells.

Keywords Twotoothed achyranthes root; Neural stem cells; Proliferation; Bioactive part screening

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.002

多數神经系统疾病如阿兹海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症均显示与功能性神经细胞大量丢失相关[1]。神经细胞的恢复高度依赖于神经干细胞，神经干细胞（Neural Stem Cells，NSCs）作为一类神经前体母细胞，不仅具有高度自我更新能力，而且存在多向分化的潜能[2]。NSCs主要存在于哺乳动物的中枢神经系统，如脑室下区和海马区齿状回[3]。在特定的环境中，NSCs的增殖分化过程受到胞内信号分子以及胞外信号分子的调控，随后增殖分化成包括神经元、少突胶质细胞和星状胶质细胞等在内的不同类型的神经细胞[4]。而NSCs由于其高度的自我更新能力以及可塑潜能成为目前应用前景广阔的细胞替代疗法[5]。

中医认为肾和脑关系密切，肾为先天之本，藏精生髓，上通于脑，因此，肾精不足，髓海失充，治疗时以补肾填精为主。牛膝为苋科牛膝属植物Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，牛膝味甘性微温，入肝肾经，具有补肝肾，强筋骨，引血下行等功效[6]。牛膝中含有齐墩果酸型三萜皂苷类化合物、甾酮类化合物以及多糖类化合物等多种化学成分[7]，因而具有多种药理活性，如促进大鼠NSCs的再生作用[8]、调节免疫作用[7]等。在本课题组关于人参皂苷、三七皂苷等中药活性成分对NSCs存活、增殖和分化的药理作用机制探讨中已成功分离培养了胚鼠NSCs，并通过免疫荧光染色鉴定为NSCs，且纯度达到95%[9-11]。基于此，本实验旨在研究牛膝的不同提取分离部位对体外培养的胚鼠NSCs的增殖作用，为进一步探索牛膝促NSCs增殖的物质基础与作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD大鼠1只，约450 g，怀孕15～17 d，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2016-0002，饲养于北京中医药大学良乡动物房，于室温约24 ℃，自然昼夜节律饲养，自由进食饮水。

1.1.2 药物 牛膝（安国市昌达中药材饮片有限公司，批号1901001），经北京中医药大学中药学院中药鉴定系刘春生教授鉴定为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根。

1.1.3 试剂与仪器 DMEM/F12（赛默飞公司，美国，货号：C11330500BT），B27添加剂（赛默飞公司，美国，货号：17504-044），胎牛血清（天杭生物科技公司，货号：70220-8611），bFGF（赛默飞公司，美国，货号：DXT-13256029），CCK-8（同仁化学研究所，日本，货号：CK04）;倒置相差显微镜（尼康公司，日本，型号：ECLIPSE Ts2），二氧化碳恒温培养箱（赛默飞公司，美国，型号：3111），酶标仪（Bio Tek公司，美国，型号：Epoch）。

1.2 方法

1.2.1 牛膝不同分离部位的制备 牛膝经70%乙醇回流提取，浓缩，得牛膝醇提物。醇提水沉后，得牛膝沉淀和牛膝上清;牛膝上清经水饱和正丁醇萃取，浓缩后得到牛膝正丁醇部位和剩余水部位。

1.2.2 牛膝多糖部位的制备 将1.2.1中的牛膝药渣烘干，加水煎煮，浓缩，浓缩液缓慢加乙醇并搅拌至含醇量为80%，沉淀用80%乙醇洗涤，经脱蛋白后制得牛膝多糖部位。

1.2.3 牛膝正丁醇部位经大孔树脂洗脱的制备   牛膝正丁醇部位过AB-8型大孔树脂柱，以水和10%、30%、50%、70%、90%的乙醇进行梯度洗脱，经浓缩后得不同洗脱部位，依次编号为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5和Fr.6。

1.2.4 完全培养基的配制 DMEM/F12、bFGF、B27和青链霉素配制成NSCs无血清的完全培养基。

1.2.5 药物的配制 牛膝的各部位均用完全培养基配制成1 000 μg/mL的储备液，过滤膜除菌，保存至4 ℃冰箱。实验前用完全培养基稀释成相应浓度的工作液。

1.2.6 NSCs原代培养 将孕鼠麻醉，取出胎鼠，置于75%乙醇中。在超净台内解剖胎鼠，取出大脑，分离海马组织并将其转移至DMEM/F12培养基中，剪碎，用无菌吸管吹打至无组织团块，加胰蛋白酶消化，10%胎牛血清终止消化，离心，弃上清，加完全培养基并吹打成细胞悬液，过200目细胞筛后得单细胞悬液，调整细胞密度为1.0×106/mL，接种于细胞培养瓶内，置于培养箱中培养，观察细胞生长情况，每2～3 d半量换液，每5～7 d传代。

1.2.7 检测指标与方法 将第3代状态良好的NSCs以5.0×105/mL密度接种于96孔板中，每组5个复孔，每孔加入100 μL细胞悬液，然后在各给药组中分别加入100 μL不同浓度的牛膝提取物的工作液。其中牛膝醇提物、牛膝多糖、牛膝上清、牛膝沉淀、牛膝正丁醇部位和剩余水部位的终浓度依次为6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL;而牛膝正丁醇层过大孔树脂的各洗脱部位Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5和Fr.6的终浓度依次为1.55 μg/mL、3.1 μg/mL、6.2 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL。对照组各孔分别加入100 μL完全培养基。药物调零组（不含细胞）各孔分别加入100 μL完全培养基和100 μL对应浓度的各药物的工作液。空白调零组（不含细胞）各孔分别加入200 μL完全培养基。置于培养箱中培养48 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，于培养箱中培养4 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD）值。实验平行3次。细胞增殖率的计算公式如下：增殖率（%）=[（OD调整给药组-OD调整对照组）/OD调整对照组]×100%。其中，OD调整给药组=给药组OD值-药物调零组OD值;OD调整对照组=对照组OD值-空白调零组OD值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCs原代培养与鉴定 刚接种时，在显微镜下可见均匀分布且透亮圆球状的单个细胞懸浮生长;24 h后镜下观察可见由数个细胞聚集成不规则透亮的细胞团，周围悬浮着一些透光性差的细胞碎片;72 h后镜下可见立体感强且折光率大的类圆形神经球，同时存在少量细胞贴壁生长;5～7 d后，镜下可见大量神经球且神经球的体积和数量随着培养时间延长而变大增多。传代后的NSCs，细胞碎片明显减少，镜下视野更纯净。见图1。上述经原代分离培养得到的NSCs，在本课题组前期实验工作中已被鉴定为NSCs，且纯度达95%[11]。

2.2 牛膝醇提物与牛膝多糖对NSCs增殖能力的影响 本实验通过CCK-8法检测各组吸光度值，并采用1.2.7中的公式对其增殖率进行计算，结果见表1、图2。牛膝多糖（6.25 μg/mL，12.5 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL，P<0.05）对NSCs的增殖有显著的促进作用。

2.3 牛膝上清与牛膝沉淀对NSCs增殖能力的影响  牛膝上清（25 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，P<0.05）对NSCs的增殖有显著的促进作用;牛膝沉淀与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2、图3。

2.4 牛膝正丁醇部位与牛膝剩余水部位对NSCs增殖能力的影响 牛膝正丁醇部位（12.5 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL，P<0.05）对NSCs的增殖有显著的促进作用;剩余水部位与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），结果如表3及图4所示。

2.5 牛膝正丁醇部位过大孔树脂柱后，其各洗脱部位对NSCs增殖能力的影响 水和10%、30%、50%、70%、90%的乙醇梯度洗脱，得不同洗脱部位，依次编号为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5和Fr.6。其多个洗脱部位（Fr.2，Fr.3，Fr.4，Fr.5，Fr.6）均显著地促进NSCs增殖（P<0.05），当药物浓度为3.1 μg/mL时，Fr.3，Fr.4，Fr.5和Fr.6部位促NSCs增殖能力最佳。见表4、图5。

3 讨论

神经退行性疾病是全球老年人中发病率较高的疾病之一，其缺乏有效的治疗手段，严重危害其身心健康。该疾病是由于神经元及髓鞘逐渐丧失而导致的神经功能障碍[12]。NSCs是一类具有增殖、迁移和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群[2]。其自我更新能力和分化潜能为神经退行性疾病的治疗提供了广阔前景，最大程度地激发内源性NSCs增殖、迁移至病灶（损伤区域），可促使其分化成相应的神经细胞，参与神经修复并恢复大脑受损功能。

中医的肾-脑相关理论源于《黄帝内经》“人始生，先成精，精成而脑髓生”“脑为髓之海”等记载。肾精化生为脑髓，髓海得养，脑的生理功能才可以发挥正常[13]。中医所指的“脑髓”，类似于现代生物学基础的脑内神经元和神经营养因子，当脑内神经元大量丢失会造成“髓海不足”，故可以通过“补肾填髓”法来治疗“髓海空虚”的脑部疾病[14]。中医理论中的“精”（先天之精和后天之精）与现代医学中的干细胞有密切的联系，干细胞的属性与“精”的繁衍、生长发育、濡养的作用类似，因此可推测干细胞是先天之精在细胞层次的存在形式[15]。吉云鹏[16]通过补肾方药对肾虚大鼠进行干预，探究肾主藏精和海马神经干细胞增殖的内在关系，发现补肾方药可通过激活Wnt信号通路来调控并促进NSCs的增殖和分化。

牛膝味甘性微温，入肝肾经，具有补肝肾，强筋骨，引血下行等功效[6]。牛膝作为一种使用历史悠久的常用中药，其在《本草经集注》中记载：治伤中少气，补中续绝，益精，填骨髓，除脑中痛;在《本草纲目》中记载：其滋补之功，如牛之多力也。现代药理研究表明牛膝可提高海马神经元的活力，促进海马神经元突起生长及突触的形成[17]。

实验结果表明，牛膝正丁醇部位及其多糖部位对NSCs增殖有明显的促进作用，为寻找其作用的物质基础，并进一步探索其作用机制奠定了基础。

參考文献

[1]Barnham KJ，Masters CL，Bush AI.Neurodegenerative diseases and oxidative stress[J].Nat Rev Drug Discov，2004，3（3）：205-214.

[2]Gage FH.Mammalian neural stem cells[J].Science，2000，287（5457）：1433-1438.

[3]Ago Y，Yoneyama M，Ishihama T，et al.Role of endogenous pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in adult hippocampal neurogenesis[J].Neuroscience，2011，172：554-561.

[4]Fujita S.The discovery of the matrix cell，the identification of the multipotent neural stem cell and the development of the central nervous system.Cell structure and function 2003，28（4）：205-228.

[5]洪峰.Ezh2通过调节H3K27me3调控多巴胺能神经元发育及成体神经干细胞神经发生的相关机制研究[D].北京：中国科学院大学，2019.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：72.

[7]He X，Wang X，Fang J，et al.The genus Achyranthes：A review on traditional uses，phytochemistry，and pharmacological activities[J].J Ethnopharmacol，2017，203：260-278.

[8]韦相兰，黄李平，李凯，等.怀牛膝对重型颅脑损伤大鼠脑组织Nestin表达的影响[J].四川中医，2011，29（5）：59-61.

[9]谢爱兰，狄小丹，陈小鸣，等.未足月胎膜早破患者发生组织学绒毛膜羊膜炎的影响因素及新生儿结局[J].中华妇产科杂志，2012，47（2）：105-109.

[10]万凤，司银楚，牛欣.人参皂苷作用于星形胶质细胞对中风后神经干细胞增殖和分化的影响[J].中华中医药杂志，2016，31（5）：1617-1624.

[11]张建平，司银楚，朱培纯.三七总皂苷对体外培养的大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用[J].解剖学报，2010，41（3）：362-366.

[12]薛小燕，郭小华，李敏，等.神经退行性疾病发病机制研究进展[J].中国老年学杂志，2015，35（11）：3149-3151，3152.

[13]唐璐，张明慧.从脑肾相关理论探讨中风病急性期临床治疗的思路[J].世界中医药，2017，12（7）：1500-1503.

[14]李林，魏海峰，张兰，等.中医“肾生髓，脑为髓海”现代生物学基础探讨[J].中国中药杂志，2006，31（17）：1397-1400，1417.

[15]张进，徐志伟，陈群，等.干细胞与中医基础理论中的先天之精学说[J].中国临床康复，2006，10（7）：189-192.

[16]吉云鹏.补肾治法对肾虚大鼠海马神经干细胞增殖机制的研究[D].广州：广州中医药大学，2015.

[17]程琼，姜纯一，王彩萍，等.牛膝活性提取物对大鼠海马神经元生长的促进作用[J].解剖学杂志，2014，37（5）：594-598.

（2019-10-01收稿 责任编辑：王明）