向阳 陈莹 黄志军

摘要 目的：基于HPLC指纹图谱和穗花杉双黄酮的含量测定结果，对不同产地五灵脂药材质量进行评价。方法：采用HPLC建立五灵脂指纹图谱和穗花杉双黄酮含量测定方法，并运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统和统计软件进行结果分析。结果：不同产地的五灵脂指纹图谱和穗花杉双黄酮含量有其专属性，其中陕西、山西、安徽、河北四产地的指纹图谱相似度高，且穗花杉双黄酮含量>0.020%。结论：不同产地的五灵脂质量存在较大差异，可能与其复齿鼯鼠食物来源有关，需控制鼯鼠食物来源，保证市场上五灵脂质量稳定性。

关键词 五灵脂;HPLC指纹图谱;穗花杉双黄酮;质量评价

Abstract Objective：To evaluate the quality of Faeces Trogopterori medicinal materials from different origins based on the results of HPLC fingerprinting and content determination of amentoflavone.Methods：HPLC was used to establish the fingerprints of Faeces Trogopterori and the content determination methods of amentoflavone.The similarity evaluation system of traditional Chinese medicine chromatography and statistical software were used to analyze the results.Results：Faeces Trogopterori Fingerprints and the content of amentoflavone in different habitats were specific.Among them，those in Shanxi，Shanxi，Anhui，Hebei and Hubei had high similarity，and the content of amentoflavone was more than 0.020%.Conclusion：There is a great difference in the quality of Faeces Trogopterori from different producing areas，which may be related to the food source of the compound toothed squirrel.It is necessary to control the food source of the compound toothed squirrel to ensure the stability of Faeces Trogopterori on the market.

Keywords Faeces Trogopterori; HPLC fingerprint; Amentoflavone; Quality evaluation

中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.003

五灵脂为鼯鼠科动物复齿鼯鼠（Trogopterus Xanthipes Milne-Edwards）的干燥粪便[1-2]，始载于宋《开宝本草》：“五灵脂出北地，寒号虫粪也”[3]，性温，味咸、甘，归肝经，临床主要用于治疗痛经、血瘀经闭、胃溃疡、蛇虫咬伤等疾病，现代药理实验表明五灵脂还具有抗炎、清除自由基、抗动脉粥样硬化、治疗慢性心力衰竭等作用[4-10]。复齿鼯鼠主要分布在山西、河北、陕西、河南、湖北、北京、甘肃、辽宁、吉林、重庆、云南等地[11]，现今陕西商洛已有大量复齿鼯鼠养殖基地，基地鼯鼠多以侧柏叶为主食。侧柏叶主要含有黄酮类物质，是其降血糖、降血脂的有效部位[12-13]，包括槲皮苷、杨梅苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮等[8]，其中双黄酮类是其主要活性成分，特别是穗花杉双黄酮，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、血管舒张作用等生理活性[14-16]，焦玉提取分离鉴定出五灵脂中也含穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮，并对两双黄酮进行了含量测定[17]，王岚等[18]比较了野生与家养五灵脂在药效方面的差异性，但尚未有文献报道对多产地的五灵脂进行对比分析。本实验以陕西产五灵脂为主要研究对象，将陕西五灵脂指纹图谱和穗花杉双黄酮含量测定结果与其与他产地五灵脂进行对比，阐明产地对五灵脂质量影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，型号：ME104E型，AB204-E型）;Waters e2695高效液相色谱仪（美国沃特世）;Dionex高效液相色谱仪（美国戴安）;UA800-DH数字式超声波清洗仪（上海欧河机械设备有限公司，功率800 W，频率40 kHz，）;Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）色谱柱;YMC-TriartC18？？柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。

1.2 试剂

穗花杉双黄酮对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111902-201102，纯度：90.2%）;扁柏双黄酮（上海源叶生物科技有限公司，批号：YO3N7S13157，纯度：91.0%）;乙腈（色谱纯，MREDA，美国）;纯化水自制;其余试剂均为分析纯。

1.3 分析样品

22批五灵脂药材产地及来源见表1，根据本草考证结果和已收载本品的湖北省级中药材标准及有关文献专著记载情况，确定均为鼯鼠科动物复齿鼯鼠的干燥粪便。

2 方法与结果

2.1 陕西五灵脂指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SBC18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）;以乙腈（A）-0.5%冰醋酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱，0～35 min，A相8%～23%;35～45 min，A相23%～40%;45～70 min，A相40%～52%;流速为1.0 mL/min;检测波长为270 nm;柱温30 ℃;进样量为10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取穗花杉双黄酮对照品适量，加甲醇溶解，制成每1 mL含约7 μg的溶液作為对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取五灵脂样品粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，精密加甲醇50 mL，称重，回流提取1 h，放冷，再称定重量，用提取溶剂溶液补足减失重量，滤过，滤液经微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.1.4 精密度试验

取供试品溶液按照“2.1.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD值均小于1.0%，相对峰面积的RSD值均小于5.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性实验

取供试品溶液按照上述色谱条件，在0、2、4、6、8、10、12 h测定，记录色谱图。结果表明，12 h内7次进样所得图谱的各色谱峰相对保留时间的RSD值均小于1.0%，相对峰面积的RSD值均小于5.0%（n=7），表明供试品溶液在12 h内较稳定。

2.1.6 重复性试验

取同一批号样品6份，按照上述供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，记录色谱图。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD值均小于1.0%，相对峰面积的RSD值均小于5.0%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.7 陕西五灵脂指纹图谱构建及相似度评价

将产地为陕西的14批五灵脂色谱图导入运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012年版）进行相似度评价，14批样品的色谱叠加图谱见图1。以170713批样品的色谱图为参照图谱，时间窗宽度为0.5 min，以中位数法，经多点校正、自动匹配后生成陕西五灵脂对照指纹图谱，并标定8个共有峰，经指认其中6号峰为穗花杉双黄酮、8号峰为扁柏双黄酮，如图2所示。根据指纹图谱相似度评价结果，14批五灵脂样品的相似度均大于0.8，其中13批样品相似度大于0.9，结果表明陕西五灵脂质量稳定。相似度计算数据见表2。

2.1.8 陕西五灵脂与其他产地五灵脂的色谱图比较

将陕西五灵脂与其他产地的五灵脂样品按文中建立的指纹图谱条件进行色谱图对比，结果见图3，其中从下到上（S9-S1）分别为陕西、四川、新疆、安徽、内蒙、河北、甘肃、湖北、山西。以陕西的五灵脂对照图谱为参照图谱，四川、新疆、安徽、内蒙、河北、甘肃、湖北、山西的五灵脂图谱相似度分别为0.476、0.079、0.929、0.146、0.957、0.585、0.189、0.960，由此可见各产地的五灵脂质量差异大，根据与陕西五灵HPLC脂指纹图谱的相似度大小，将样品分为2类：I类相似度大于80%，II相似度小于80%。其中陕西、安徽、山西、河北相似度大于80%，为I类，新疆、内蒙、甘肃、湖北、四川相似度较低，处于7.9%～58.5%之间为II类。

2.1.9 聚类分析

以各样品8个共有峰面积为变量，运用SPSS 21软件进行系统聚类分析，分析结果见图4，将样品大致分为2类，I类为陕西、安徽、山西、河北产地五灵脂，II类为新疆、甘肃、内蒙、四川、湖北五灵脂，说明产地与五灵脂质量有一定影响，聚类结果与“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”结果相似。

2.1.10 主成分分析

将22批五灵脂的8个共有峰面积导入到SIMCA-P软件进行主成分分析，分析结果见图5，PC1=45.57%、PC2=16.93%、PC3=12.33%，共解释了74.83%的变量，表明此8种成分含量可基本实现对五灵脂整体质量控制，主成分分析大致按照不同产地将22批样分为2组，与聚类分析相照应，同时实现了对五灵脂产地的鉴别。

2.2 五灵脂中穗花杉双黄酮含量测定

2.2.1 色谱条件

采用YMC-TriartC18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）;以乙腈-0.5%冰醋酸溶液（43∶57）为流动相，等度洗脱;检测波长为330 nm;流速为1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样10 μL。对照品及样品色谱图见图6。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取穗花杉双黄酮对照品5.22 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，制成每1 mL含0.047 08 mg的溶液作为对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备

见“2.1.3”。

2.2.4 线性关系考察

取上述穗花杉双黄酮储备液（浓度为0.047 08 mg/mL）1 mL，2 mL，3 mL、4 mL、5 mL分别定容至100 mL、50 mL、25 mL、25 mL、25 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密吸取10 μL，按上述色谱条件测定。以进样量（X：ng）和峰积分面积（Y：μV×s）进行线性回归，得回归方程Y=14.655X+2.247 1（r=0.999 6）。结果表明，穗花杉双黄酮进样量在4.71～188.3 ng的范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

取上述对照品溶液按“2.2.1”色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算RSD值为0.86%（n=6），结果表明仪器精密性良好。

2.2.6 稳定性试验

取同一批供试品溶液（陕西170713批），分别于0、3、6、12、18、24 h进样10 μL，测定峰面积，计算含量，RSD值为1.02%（n=6），提示供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2.2.7 重复性试验

取同一批五灵脂粉末（陕西170713批）6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，记录峰面积，计算得穗花杉双黄酮含量的平均值为0.035 25%，RSD值为2.24%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.2.8 回收率试验

取已知含量的五灵脂粉末（陕西170713批）6份，约0.5 g，精密称定，精密加入对照品溶液（浓度为0.470 8 mg/mL）3 mL，按供试品制备方法制备样品，测定，计算回收率，结果见表3，平均回收率为101.66%，RSD值为2.19%（n=6），结果表明方法准确性良好。

2.2.9 样品含量测定

对五灵脂22批样品进行测定，结果见表4。结果显示，不同样品中穗花杉双黄酮含量在0%～0.049%范围内，表明不同产地五灵脂中穗花杉双黄酮含量差异较大。

3 讨论

五灵脂主要来源于以侧柏叶为主食的复齿鼯鼠排泄物，活性成分主要为黄酮类物质，如槲皮苷、杨梅苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮等，在指纹图谱研究过程中，为了尽可能多的提取主要代表性成分，本研究分别比较了超声和回流2种提取方式，并考察了甲醇和乙醇2种不同溶剂的提取效果。此外，考察了样品在220 nm、250 nm、270 nm、300 nm等不同波长下的吸收情况。研究结果表明：五灵脂药材采用甲醇回流提取，在270 nm波长下检测，出峰个数最多，峰形较好，基线平稳，因此选择条件下确保了所建立的指纹图谱共有模式更有代表性。

笔者在前期对其他产地五灵脂研究基础上，分别选取了来源于陕西、安徽、山西、河北、新疆、甘肃、内蒙、四川、湖北等产地具有代表性批号的五灵脂样品，用已建立的陕西五灵脂HPLC指纹图谱为对照，对其他产地五灵脂进行相似度评价，色谱图相似度分析结果与共有峰面积聚类分析、主成分分析结果一致，将五灵脂分为2类，陕西、安徽、山西、河北产地五灵脂为一类，新疆、甘肃、内蒙、四川、湖北五灵脂为另一类，这说明安徽、山西、河北复齿鼯鼠饲养条件同陕西一致，而新疆、甘肃、内蒙、四川、湖北可能以其他食物为主，侧柏叶为辅，具体食材还有待考察。同时，以侧柏叶中代表性活性成分穗花杉双黄酮为评价指标，结果发现来源于内蒙、湖北、新疆的五灵脂中穗花杉双黄酮未检出，而其相应的指纹图谱相似度偏低，结合聚类分析结果，发现这几个产地五灵脂均归为II类，可见不同评价方法结果具有一致性。本研究将指纹图谱整体性评价与代表性活性成分含量评价相结合，可更全面的评价药材质量，且后续应用中可进一步控制五灵脂药材质量，有利于减少药材批间质量差异化。

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（2020-03-30收稿 责任编辑：徐颖）