王雪 孙长岗

摘要 目的：目前青黛已是治疗急性幼粒细胞白血病（APL）的临床有效药物，但其分子机制与物质基础仍不明确。基于此本研究构建青黛与APL可视化药靶蛋白模型，以探究青黛作用于APL的分子机制。方法：通过GEO数据库检索APL微阵列芯片分析APL差异表达基因，使用TCMSP数据库筛选青黛活性成分，结合PubChem和SwissTargetPrediction匹配活性成分的靶基因并进行富集分析。String用于挖掘并构建APL可视化蛋白互作数据，将其读入Cytoscape，通过Centiscape实现网络拓扑分析。综合APL差异表达基因，通过Sybyl与青黛活性成分构建药靶蛋白模型。结果：筛选出3张APL微阵列芯片，164个差异表达基因，9种青黛活性成分，541个靶基因，这些靶点较多地参与细胞凋亡、药物结合、癌症途径、慢性粒细胞白血病等，这些都在APL中起重要作用。拓扑分析显示ELANE，CTSS为核心基因，将其与青黛9种活性成分进行药靶蛋白模型预测，显示靛玉红和靛蓝与核心基因结合度最佳。结论：APL是受多基因调控的复杂疾病，而青黛成分中靛玉红和靛蓝可通过结合ELANE，CTSS作用于APL的发生发展。

关键词 急性幼粒细胞白血病;青黛;药靶蛋白模型;靛玉红;靛蓝;基因;网络药理;生物信息

Abstract Objective：Atpresent，NaturalIndigohasbeenusedasaclinicaldrugforthetreatmentofacutepromyelocyticleuke-mia（APL），butitseffectivemolecularmechanismandmaterialbasisarestillunclear.ThepurposeofthisstudyistoconstructthevisiblemodelofNaturalIndigoandAPLdrugtargetprotein，andtoexplorethemolecularmechanismofNaturalIndigoactingonAPL.Methods：TheAPLmicroarraychipwassearchedthroughtheGEOdatabasetoanalyzethediseasedifferentiallyexpressedgenes.TheTCMSPdatabasewasusedtoscreentheactiveingredientsofNaturalIndigo.PubChemandSwissTargetPredictionwereCombinedtomatchtargetgenesofactiveingredientsandenrichmentanalysisoftargetgeneswasdone.StringwasusedforfurthertextminingandconstructingaAPLvisualproteininteractionnetwork，theinteractiondatawasreadintoCytoscape，thenetworkto-pologyanalysiswasdonethroughthepluginCentiscape.AftercomprehensiveanalysisofAPLdifferentiallyexpressedgenes，SybylwasconstructedofdrugtargetproteinmodelwithNaturalIndigoactiveingredients.Results：ThreeAPLdisease-relatedmicroarraychips，164differentiallyexpressedgenes，9NaturalIndigoactivecomponents，541componenttargetgeneswerescreened.Thesetargetsaremoreinvolvedinapoptosis，drugcombination，cancerpathway，chronicmyelogenousleukemia，etc.，allofwhichplayanimportantroleinAPL.TopologicalanalysisshowedthatELANEandCTSSwerecoregenes，thedrugtargetproteinmodelpre-dictionwiththe9activeingredientsofNaturalIndigoshowsthatindirubinandindigohavethebestbindingtocoregenes.Conclu-sion：APLisacomplexdiseaseregulatedbymultiplegenes.TheindirubinandindigoinNaturalIndigocanactonthedevelopmentofAPLbycombiningELANEandCTSS.

Keywords Acutepromyelocyticleukemia;NaturalIndigo;Drugtargetproteinmodel;Indirubin;Indigo;Gene;Networkpharmacol-ogy;Biologicalinformation

中圖分类号：R285.6 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.004

急性早幼粒细胞白血病（AcutePromyelocytic Leukemia，APL）是急性髓系白血病的M3亚型，根据

其发热、出血、贫血、感染和浸润等临床表现，可归类于中医“虚劳”“血证”“温病”等范畴。古代文献中虽无白血病之名，但有较多疾病症状的相似记载。《圣济总录》：“热劳之证，心神躁、面赤、头痛、眼涩、唇焦、身体壮热，烦渴不止，口舌生疮，食欲无味，肢体疼痛，多卧少起或时汗，日渐赢疫者是也”[1]。《素问·腹中论》记载：“病至则先闻腥臊臭，出清液，先唾血，四肢清，目眩，时时前后血……病名血枯”[2]。《普济方》曰：“夫热劳者，由心肺实热，伤于气血，气血不和，脏腑壅滞，积热在内，不能宣通所致也”[3]。上述症状均与APL的临床表现相似。应用全反式维甲酸、三氧化二砷联合化疗是APL的标准治疗方案[4]，这很大程度上提高了疾病缓解率，但是维甲酸综合征、高白细胞危象、高颅压综合征等不良反应和高复发率促使临床不断探究新的治疗方法，而中药效缓、稳定、不易产生耐药性更可以缓解化疗的不良反应，使中药成为APL的综合治疗中不可或缺的一部分。周霭祥教授临床应用青黛治疗白血病多年[5]，疗效确切，但其作用机制尚不明确，值得进一步探究。

1 研究对象

青黛，别名靛花、靛沫、蓝靛，为双子叶爵床科植物马蓝、蓼科植物蓼蓝、豆科植物木蓝或十字花科植物菘蓝的茎叶经加工制得的干燥粉末或团块，味咸苦，性寒，归肝经，具有清热解毒、凉血止血、入营化斑、清肝泻火等功效，主治温病热盛、小儿惊痫、斑疹、吐血、咯血、疮肿、丹毒、蛇虫咬伤等。青黛在古代医书中的药用记载始于《药性论》[6]，君，味甘，平。能解小儿疳热，消瘦，杀虫。另《本草求真》[7]云，青黛专入肝，系蓝靛浮沫，搅澄，掠出取干而成。

味咸性寒，色青，大泻肝胆实火及肝经郁热。《本草衍义补遗》[8]所言青黛能收五脏之郁火，解热度，泻肝，消食积。可见先人对于青黛的药效有所肯定，而自二十世纪九十年代有大量的成功病例显示将青黛及其方剂用于治疗急性早幼粒细胞白血病有良好的治疗效果[9-11]。有研究证实[12]青黛的有效成分靛玉红具有抗肿瘤活性，用同位素标记前体分别渗入肿瘤组织的DNA、RNA及蛋白质的研究显示，靛玉红可以抑制急性幼粒细胞白血病患者的白血病细胞的DNA合成代谢，轻微抑制RNA合成，证实青黛有抗肿瘤的作用，但没有系统的青黛与APL的研究。为详细的阐明青黛活性成分与APL的相互作用，本文通过构建青黛与APL药靶蛋白模型可视化青黛作用于APL的内在机制，为青黛治疗APL提供理论基础。

近年来，随着系统生物学的不断创新和发展，可视化模型模拟技术为探索中药有效成分干预的内在原理，构建中医药多靶点精确治疗模式提供了可行的研究策略。本研究通过以下方面探究青黛与APL的作用机制：1）检索APL疾病表达数据，并分析差异表达基因;2）筛选青黛的活性成分，预测活性成分靶基因;3）分析APL差异表达基因与青黛活性成分可能的作用靶基因的关系，筛选出核心基因;4）核心基因与青黛活性成分构建可视化药靶蛋白模型。通过以上分析来探究青黛与APL的内在关系，为中药作用于疾病系统的提供理论见解。

2 研究方法

2.1 APL差异表达基因 基因表达数据库（GEO，GENEEXPRESSION OMNIBUS，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）隶属于美国国立卫生研究院，是现在最大最全面的公共基因表达数据资源[13]。从GEO中检索apl的微阵列芯片，设定筛选条件为“Homosapiens”，共检索到917张APL相关芯片。

进一步分析每张芯片的样本数据后确定3张芯片作为APL 的疾病数据，即GSE34823，GSE12662，GSE995。将每张芯片的APL疾病样本和正常对照样本进行分组，通过GEO2R进行差异表达基因分析，得到差异表达基因后进行筛选，条件设置为adj.P.Val<0.05且|logFC|>1。

2.2 青黛所含活性成分的收集与处理 中药系统药理学数据库（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-sp.php）由中华人民共和国药典记载的499种中药组成，含有29384种成分，3311种靶点，837种相关疾病[14]。提供了人体口服生物利用度、半衰期、药物相似性、Caco-2通透性和血脑屏障等12项重要的ADME相关特性来进行药物筛选和评价。通过TC-MSP获取青黛的活性成分，根据成分的药物动力学参数进行筛选，将口服生物利用度（OB）≥30%且成药相似性（DL）≥0.18作为筛选条件。结合有机小分子生物活性库（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和SwissTargetPrediction数据库（ht-tp：//www.swisstargetprediction.ch/）预测每个活性成分对应的靶基因。

2.3 基因分析 DAVID （DAVID：https：//DAVID.ncifcrf.gov/）是一个全面的功能注释工具，能够分析大量基因背后的生物学意义[15]。将青黛靶基因上传至DAVID进行基因本体论（GeneOntol-ogy，GO）和京都基因与基因组百科全书（KyotoEn-cyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）分析，显示路径的截止阈值设为P<0.05。

2.4 网络构建 String数据库（https：//String-db.org/cgi/input.pl）是一个预测已知蛋白相互作用关系的在线数据库，共有5090个物种和24584628种蛋白[16]。Cytoscape是一个专注于蛋白质网络可视化和分析的软件，其核心是提供基础的功能布局和查询网络[17]。利用String数据库和Cytoscape

3.5.1软件构建APL差异表达基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。使用Centiscape2.2对PPI网络进行拓扑分析。Centiscape2.2插件基于直径，度数，压力，中介性，放射性，紧密度，质心值，离心值执行拓扑分析，筛选出最显著的差异表达基因为核心

基因。

2.5 可视化药靶蛋白分析 应用SybylX8.1中的SurflexDock程序构建青黛活性成分与APL显著差异基因的可视化药靶蛋白模型。在PubChem数据库获取青黛活性成分的小分子文件作为配体，从PDB数据库中下载拓扑分析得出的ALP显著差异基因三维晶体结构作为受体，除去晶体分子所有的水分子和小分子配体，并加极性氢，加载电荷，构建活性口袋。再输入小分子文件，分别构建药靶蛋白模型。用配体受体亲和力的一致性评分函数进行打分，并对药靶蛋白模型进行观察、分析。

3 结果分析

3.1 基因比较分析 通过数据库筛选出青黛的9个活性成分。见表1。成分的作用靶基因541个。

分析APL3张芯片后，发现GSE34823含有626个差异表达基因，GSE12662含有13481个差异表达基因，GSE995含有2128个差异基因。Veen（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny_old/index.html）在線分析后，得到164个三芯片共同差异基因，即APL差异表达基因。见图1。将541个青黛作用靶点基因和164个APL差异表达基因比较分析，发现共同重叠基因10个，分别是ELANE，CFD，CTSS，QPCT，MCL1，TYMP，PRKCH，CCNA1，DYRK2，CTSL。

3.2 青黛靶基因富集功能 通过DAVID6.8工具

对青黛作用靶基因进行GO和KEGG通路的功能富集，从而揭示青黛治疗APL的潜在作用机制。结果得出青黛靶基因主要富集到的功能涉及凋亡过程的负调控、细胞内信号转导、细胞增殖、细胞核等GO功能和癌症、PI3K-Akt、cAMP、病毒致癌、神经活性配体-受体相互作用等KEGG通路，与APL密切相关。见图2。

3.3 APL网络构建分析 通过Cytoscape软件构建出APL蛋白-蛋白相互作用网络，由145个节点和824条边组成。见图3。根据拓扑学指标Degreeun-Dir，DegreeunDir值最大的节点处于PPI网络调控的中心，故选择DegreeunDir≥17.5%来筛选此网络核心节点，即ITGAM，CXCL8，ELANE，ITGB2，CD86，CTSS等。见图4。我们综合分析结果，筛选出此网络的核心节点ELANE，CTSS既是青黛靶基因和APL差异表达基因的共同重叠基因又是PPI网络的核心节点，故选择这2个基因最下一步药靶蛋白构建。

3.4 青黛活性成分与APL可视化药靶蛋白构建 通过将2个核心基因ELANE、CTSS与青黛9种活性成分构建药靶蛋白模拟发现，青黛的活性成分靛玉红、靛蓝与ELANE，CTSS结合度较高，提示靛玉红、靛蓝干预ELANE，CTSS可能在青黛治疗APL中起重要作用。见图5。

4 讨论

APL是属于急性非淋巴细胞白血病的恶性肿瘤，占成人急性非淋巴细胞白血病10%～15%，发病中位年龄约40岁，男女发病率基本相等[18]。西医学认为APL主要的发病机制为特征性染色体15号和17号染色体分别断裂并易位t（15;17），在分子水平形成PML-RARα融合基因，其翻译产物PML-RARa融合蛋白阻滞白细胞正常分化及凋亡，导致骨髓中大量的异常早幼粒细胞堆积，导致APL的发生[19]。中医学认为APL的病因病机主要为正气亏虚，损伤骨髓，复感外邪，犯营入血。骨髓是APL的病变部位，温热邪毒由表入里或发为伏火，损伤骨髓，邪毒犯营入血，耗伤阴经气血，导致脾肾亏损，进而累及其他脏腑，最终形成骨髓恶性增殖病变。故APL的治疗着重祛热解毒扶正。众多医家[10，20-21]在治疗APL上的不断探索发现全反式维甲酸、三氧化二砷联合化疗结合青黛方剂治疗能够降低早期死亡率、获得更高疗效、减少化疗不良反应等优势。青黛味咸，性寒，归肝、肺、胃经，《本草经疏》谓其“解毒除热，固其所长”，可清热、凉血、解毒，在中医理论体系指导下治疗APL可谓方证相对，促使我们对青黛作用于APL的内在机制进行探究。

我们运用药物与疾病的药靶蛋白构建技术，来阐述青黛治疗APL的有效物质基础和治疗靶点。

将复杂多样的中药成分，以及其活性成分在人体内不确定性的相互作用，转化为蛋白质为主体的系统研究。蛋白质是生命活动的主要承担者，其功能的实现，如基因表达调控，细胞信号转导，细胞增殖、凋亡、分化等均取决于蛋白质之间的相互作用[22]。因此，PPI网络的研究和分析能够可视化药物和疾病的组分、进程和功能。使用算法对研究的PPI网络进行拓扑分析，可以找到主导疾病生物行为的关键靶点，再与药物有效成分进行药靶蛋白分析，筛选出作用于疾病的最有效药物成分，为临床应用药物干预疾病提供理论基础。基于此，我们通过TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction数据库筛选青黛有效成分，GEO数据库获取APL疾病芯片后，构建了由145个节点（蛋白质）和824条边（相互作用）构成的APL的PPI，继续进行拓扑分析得出2个核心基因ELANE，CTSS，进一步与筛选出青黛的9种活性成分进行药靶蛋白构建，得出作用于APL最相关的青黛活性成分，即靛玉红、靛蓝。

靛玉红是是中国经典名方当归龙荟丸的主要活性成分，用于治疗慢性粒细胞性白血病[23]。吴琦玮[24]通过体外试验发现，靛玉红对人早幼粒白血病HL60细胞株和人白血病K562细胞株均具有明显的抑制作用。更有文献表明靛玉红能够抑制人白血病幼粒细胞合成，靛玉红与ELANE基因的对接打分为5.4478， 显示有较好的结合强度， 而ELANE与中性粒细胞数量密切相关，其突变的患者有很高的风险发展成急性髓系白血病或骨髓异常增生[25]。ArunAK通过对52名遗传性中性粒细胞减少症患者进行研究，从患者外周血白细胞中提取基因组DNA，测序进行突变分析发现ELANE出现不同的基因错义、移码或剪接位点变异，延缓中性粒细胞分裂成熟，而导致反复的细菌感染，导致骨髓疾病的发生。故靛玉红作用于ELANE进而干预骨髓内中性粒细胞的异常分化，对APL的治疗起到关键作用。

靛蓝是青黛的有效成分之一，具有抗炎镇痛作用。刘丽娟[26]研究靛蓝对构建体外RAW264.7炎性反应细胞模型进行实验发现，靛蓝通过下调IL-6的表达来减轻RAW264.7炎性反应细胞模型的炎性反应，得出靛蓝具有抗炎的作用。我们通过药靶蛋白分析显示，靛蓝与CTSS基因的对接打分是6.0087，显示有较强的结合度，而CTSS与炎性反应密切相关。CTSS是一种与自身免疫性疾病密切相关的半胱氨酸蛋白酶，在人体的生理和病理过程中发挥着至关重要的调节功能。目前已有研究证实CTSS的生物学功能与炎性反应通路相关。更有研究表明，CTSS通过促进细胞外基质降解，参与VEGF等生长因子分泌而促进肿瘤血管形成，从而促使血管内外肿瘤细胞的侵袭和转移[27]。而我们进行KEGG通路分析的结果也显示青黛活性成分的靶基因通过众多癌症途径包括VEGF信号通路参与APL的反应过程，为靛蓝起效于APL有力支持。

我们通过药理分析，得出青黛活性成分的靶基因在生物过程主要富集于细胞凋亡、细胞增殖、细胞迁移、细胞內信号传导、炎性反应等;在分子功能方面主要集中于ATP、药物结合、血红素血清素结合等;在细胞组成方面主要体现在细胞质、细胞核、细胞连接等;在通路分析主要富集于癌症途径、急性髓系白血病、慢性粒细胞白血病、VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路等。这些生理过程都与APL的发生发展密切相关。又通过进一步分析得出靛玉红和靛蓝与APL差异表达核心基因ELANE，CTSS有较好的结合强度。

本研究在临床应用青黛获取肯定疗效的前提下，将青黛作用于APL的内在分子机制通过药物与疾病的药靶蛋白模型分析，最终发现青黛的活性成分靛玉红和靛蓝可作用于ELANE，CTSS来干预APL的发生发展。从内在分子学和药理学角度为青黛干预APL提供了临床应用理论依据。此外我们构建可视化药物-疾病药靶蛋白模型，为探究中药潜在作用机制提供了新模式，也为中药作用于疾病的展现新见解。

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（2020-03-02收稿 责任编辑：王明）