鲁春花 赵凯 萨震

摘要 目的：运用系统药理学探讨大黄黄连泻心汤对治疗幽门螺旋杆菌感染的分子作用机制，挖掘潜在的作用靶点和信号通路。方法：首先利用中医药整合数据库（SymMap）筛选大黄黄连泻心汤的潜在作用靶点;从比较毒理基因组学数据库（CTD）发现幽门螺旋杆菌感染的相关疾病靶点;将筛选后的靶点输入到String中构建“大黄黄连泻心汤-幽门螺旋杆菌”的蛋白质相互作用网络（PPI）;采用在线分析工具WebGestalt对筛选出的靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。结果：获得大黄黄连泻心汤和幽门螺旋杆菌感染重合的靶点共有222个，通过PPI网络发现71个相互作用靶点，其中主要以IL6、MYC、VEGFA、CASP3、EP300、IL10、ERBB2、CDKN1A、MPO、NFE2L2为关键靶点;发现10个关键生物过程和10条关键信号通路。结论：大黄黄连泻心汤可能通过调节机体免疫炎性反应，发挥对幽门螺旋杆菌感染的治疗作用，同时可能通过抗肿瘤机制起到防止幽门螺旋杆菌感染进一步向更严重胃肠道疾病转化的作用。本研究为中医药治疗幽门螺旋杆菌提供了理论依据。

关键词 大黄黄连泻心汤;幽门螺旋杆菌;系统药理学;胃癌;网络分析

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Dahuang Huanglian Xiexin Decoction in the treatment of helicobacter pylori infection by systematic pharmacology，and to explore potential targets and signal pathways.Methods：First，the integrated Chinese medicine database （SymMap） was used to screen the potential targets of Dahuang Huanglian Xiexin Decoction; the relevant disease targets of helicobacter pylori infection was found from the comparative toxicology genomics database （CTD）; the protein interaction network （PPI） of “Dahuang Huanglian Xiexin Decoction-Helicobacter pylori” was constructed in String after the screened target entered into it; the online analysis tool WebGestalt was used to perform GO function annotation and KEGG pathway enrichment analysis on the selected targets.Results：There were 222 overlapping targets of Dahuang Huanglian Xiexin Decoction and Helicobacter pylori infection coinciding.A total of 71 interactive targets were located through the PPI network.Among them，IL6，MYC，VEGFA，CASP3，EP300，IL10，ERBB2，CDKN1A，MPO and NFE2L2 were key targets; 10 key biological processes and 10 key signaling pathways were discovered.Conclusion：Dahuang Huanglian Xiexin Decoction may play a therapeutic role in the treatment of helicobacter pylori infection by regulating the body′s immune inflammatory response and at the same time it may prevent the infection of helicobacter pylori from further transforming to more severe gastrointestinal diseases by anti-tumor mechanism.This study provides solid theoretical basis for TCM treatment of helicobacter pylori.

Keywords Dahuang Huanglian Xiexin Decoction; Helicobacter pylori; Systematic pharmacology; Gastric cancer; Network analysis

中图分类号：R285.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.005

幽门螺旋杆菌（Helicobacter Pylori，Hp）是一种能够吸附在胃的上皮细胞的革兰氏阴性、微需氧性、对生长条件要求十分苛刻的细菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中将幽门螺旋杆菌分离成功，主要寄生在人的胃里，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类，目前，西医杀灭幽门螺旋杆菌主要采用三联疗法，包括使用奥美拉唑、阿莫西林和克拉霉素持续10～14 d的疗程。值得警惕的是，由于克拉霉素的耐药性上升，导致幽门螺旋杆菌的根除率正在下降[1]。此外，临床上还有在三联的基础上联合使用铋剂，但是铋剂使用不当会引起急性肾衰竭[2-3]。中医中药治疗幽门螺旋杆菌感染有独特的优势，中医一般认为幽门螺旋杆菌感染属于脾胃积热，治疗上通常可以采用清热化湿，清热解毒等治疗思路。大黄黄连泻心汤出自《伤寒论》，原方由大黄、黄连、黄芩3味药组成。大黄能清热泻火、凉血解毒，黄连和黄芩均能清热燥湿、泻火解毒，但黄连清热燥湿之力胜于黄芩，擅长清中焦脾胃湿热。现代药理学研究，大黄的化学成分主要是蒽醌衍生物，有抗感染作用，对多种革兰氏阳性和阴性菌有抑制作用;黄连主要有效成分包括黄连碱、小檗碱，对金黄色葡萄球菌有抑制作用;黄芩有效成分主要是黄芩苷和黄芩素，对革兰氏阴性菌有不同程度的抑制作用[4]。大黄黄连泻心汤能与多种组方配伍，在中医临床上广泛用来治疗消化道炎性反应[5]，但治療机制还有待研究。近年来，系统药理学的发展为中医药研究提供了新的研究方法[6]，从而为系统深入的揭示中医药对疾病和机体的相互作用机制提供了帮助，促进了中药新药的研发。本研究主要用系统药理学的方法探讨大黄黄连泻心汤对幽门螺旋杆菌感染的治疗作用，构建大黄黄连泻心汤的关联性网络模型，筛选关键治疗靶标，对其进行功能分析，明确其有效组份对幽门螺旋杆菌的作用机制，拓展其在临床上使用大黄黄连泻心汤为基础的中医组方治疗治伴随幽门螺旋杆菌感染的胃炎及胃溃疡的可能性。

1 材料与方法

1.1 大黄黄连泻心汤的作用靶点筛选 首先通过中医药整合数据库SymMap[7]（An integrative database of traditional Chinese Medicine enhanced by symptom mapping，https：//www.symmap.org/）分别输入大黄黄连泻心汤中大黄、黄连、黄芩3味中草药的名称，选择参数P<0.05，筛选出其潜在的作用靶点。该平台将传统中医药的症状描述和现代医学分子作用机制整合在了一起，将疾病-症状-中草药-成分-靶标关联到一起，并通过直接或间接统计推断形成关系网络。

1.2 幽门螺旋杆菌感染相关疾病靶点预测 通过比较毒理基因组学数据库CTD[8]（Comparative Toxicogenomics Database，http：//ctdbase.org/），输入“Helicobacter Infections”，获取幽门螺旋杆菌感染的疾病潜在靶点。

1.3 药物-靶点网络构建 将大黄黄连泻心汤的药物潜在作用靶点与幽门螺旋杆菌感染的相关疾病靶点数据进行重叠处理，将2组数据分别导入韦恩图在线绘制工具Draw Venn Diagrams[9]（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），即可发现大黄黄连泻心汤与幽门螺旋杆菌感染的交集靶点。

1.4 预测作用靶点的蛋白质相互作用网络构建和关键靶标的筛选 将大黄黄连泻心汤和幽门螺旋杆菌感染交集靶点输入String[10]（Protein-Protein Interaction Networks，PPI，https：//string-db.org/），构建筛选出的靶点之间的蛋白质相互作用网络并进行分析。在String中首先选择“Multiple proteins”，然后输入上述靶点信息，选择“Homo sapiens”，选择最低相互作用得分为0.4，作为筛选靶点相互作用关系的参数。将String中获得的蛋白质互作网络关系导入到Cytoscape 3.7.2[11]软件中，从而使PPI互作关系可视化。使用Cytoscape中的Tool-Network Analysis-Generate Style from Statistics工具，按照网络的拓扑学参数进行可视化调整。

1.5 相关靶点的GO功能分析和KEGG通路富集分析 通过在线基因分析工具包WebGestalt[12]（Web-based Gene Set Analysis Toolkit，http：//www.webgestalt.org/）对大黄黄连泻心汤作用于幽门螺旋杆菌感染的相关靶点进行GO（Geneontology）功能富集分析和KEGG通路富集分析，发现大黄黄连泻心汤的主要作用信号通路，并对富集结果进行可视化。

2 结果

2.1 大黄黄连泻心汤治疗幽门螺旋杆菌感染的靶点预测和筛选 从SymMap数据库中查找到大黄的作用靶点有72个，黄连的作用靶点有140个，黄芩的作用靶点有106个，将三者做重合比较之后共筛选得到大黄黄连泻心汤的成分作用靶点268个，作为候选靶点。从CTD数据库中共发现潜在的幽门螺旋杆菌感染相关疾病靶点共8 048个。将大黄黄连泻心汤的靶点和幽门螺旋杆菌感染的疾病靶点作韦恩图重叠绘制后取交集，共得到222個药物-疾病作用靶点。见图1。

2.2 大黄黄连泻心汤对幽门螺旋杆菌感染作用靶点的PPI网络构建 根据String的PPI网络计算结果最终得到71个相互作用节点（Nodes），367条边（Edges），PPI网络富集P值<1.0e-16，有统计学意义，见图2。网络中的拓扑学参数包括自由度（Degree）表示网络中该节点与其他节点的连接数，用节点的大小表示，自由度越高，点越大;节点的接近中心性（Closeness）为该节点与其他节点的接近程度，用节点的颜色来表示，颜色越深表明关联性越大;关联性评分（Combined score）表示2个节点之间的关联性强度，用边的粗细来表示，边越粗意味着关联性越强。由String显示该网络节点的平均Degree为9.79，平均聚类系数为0.579。利用Cytoscape中的cytoHubba插件根据拓扑学参数Degree筛选出排序最高的前10个关键节点，包括：IL-6（白细胞介素-6），MYC（MYC原癌基因），VEGFA（血管内皮生长因子A），CASP3（caspase3），EP300（E1A结合蛋白p300），IL-10（白细胞介素-10），ERBB2（Erb-b2受体酪氨酸激酶2），CDKN1A（细胞周期素依赖性激酶抑制剂1A），MPO（髓过氧化物酶），NFE2L2（核因子 红细胞样2）。节点的颜色越深，表明得分越高。见图3。

2.3 预测作用靶点的GO功能分析 将通过PPI构建获得的71个相互作用靶点输入到WebGestalt在线工具中，依次选择“Homo sapiens”“Over-Representation Analysis”“geneontology”“Biological Process”，即可得到GO分析结果。见表1和图5。涉及的GO过程主要包括：对含氧化合物的反应，对非生物刺激的反应，对药物的反应，对脂质的反应，对氧气水平的反应，对氧气水平降低的反应，对缺氧的反应，对活性氧的反应，对有机环状化合物的反应，对无机物的反应。综上可以看出，大黄黄连泻心汤对幽门螺旋杆菌的作用靶点主要集中在对各种氧化代谢的反应过程中。见图4。

2.4 预测作用靶点的KEGG通路富集分析 再将71个相互作用靶点输入到WebGestalt在线工具中，依次选择“pathway”“KEGG”，即可获得KEGG通路富集分析结果。见表2。其中主要包括细胞周期，癌症途径，p53信号通路，前列腺癌，HIF-1信号通路，FoxO信号通路，细胞衰老，膀胱癌，PI3K-Akt信号通路，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路。见图6。

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（2020-01-23收稿 责任编辑：王明）