国倩倩 吴丹丹 高毅洁

摘要 目的：观察扶正化瘀胶囊对心梗大鼠特异性蛋白1相关通路的影響，探讨其防治心肌纤维化的可能作用机制。方法：结扎左冠脉前降支建立大鼠急性心梗模型，分为模型组和扶正化瘀组。假手术组只穿线不结扎。扶正化瘀组按0.4 g/（kg·d）灌胃，模型组和假手术组给予等体积去离子水，共8周。HE和Masson染色检测病理学变化;Western blot和实时荧光定量PCR法分别检测特异性蛋白1（Sp1）、Gata4、转化生长因子（TGF）-β1、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、血小板反应蛋白1（Tsp1）及其mRNA表达。结果：与假手术组比较，模型大鼠心肌细胞破碎，纤维结缔组织大量增生，胶原容积分数（CVF）增加（P<0.01），TGF-β1、ColⅠ、Tsp1 mRNA及Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ蛋白表达明显升高（P<0.05或P<0.01），Tsp1蛋白表达降低（P<0.01）;与模型组比较，扶正化瘀组细胞膜相对完整，胶原相对减少，CVF下降（P<0.01），Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ、Tsp1 mRNA及Gata4、ColⅠ蛋白表达明显降低（P<0.05或P<0.01）。结论：扶正化瘀胶囊在一定程度上改善心梗后心肌纤维化的作用机制可能与Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1轴有关。

关键词 扶正化瘀胶囊;心肌梗死;心肌纤维化;特异性蛋白1;转化生长因子-β1;Ⅰ型胶原;血小板反应蛋白1

Abstract Objective：To observe the effect of Fuzheng Huayu Capsule on specific protein 1 related pathway in myocardial infarction rats， and to explore its possible mechanism of prevention and treatment of myocardial fibrosis. Methods：Rats model of acute myocardial infarction were established by ligating the left anterior descending coronary artery， which were divided into model group and Fuzheng Huayu group. The sham operation group only threaded without ligation. The Fuzheng Huayu group was given intragastrically by 0.4 g/（kg·d），the model group and the sham operation group were given equal volume of deionized water for 8 weeks. Pathological changes were detected by HE and Masson staining. Western blot and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the protein and mRNA expression of specific protein 1（Sp1）， Gata4， transforming growth factor（TGF）-β1， typeⅠcollagen（ColⅠ）and thrombospondin 1（Tsp1）， respectively. Results：Compared with the sham operation group， the model rats had myocardial cells broken， fibrous connective tissue proliferated，and collagen volume fraction（CVF）increased（P<0.01），the expression of TGF-β1，ColⅠ，Tsp1 mRNA and the expression of Sp1，Gata4，TGF-β1，and ColⅠ protein were significantly increased（P<0.05 or P<0.01），and the expression of Tsp1 protein was decreased（P<0.05）.Compared with the model group， the cells membrane of Fuzheng Huayu group were relatively intact， collagen was relatively reduced， and CVF decreased（P<0.01），the expression of Sp1，Gata4，TGF-β1，ColⅠ，Tsp1 mRNA and the expression of Gata4，ColⅠ protein were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：The mechanism of Fuzheng Huayu Capsule in improving myocardial fibrosis after myocardial infarction may be related to the Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1 axis.

Keywords Fuzheng Huayu Capsule; Myocardial infarction; Myocardial fibrosis; Specific protein 1;Transforming growth factor-β1;TypeⅠcollagen;Thrombospondin 1

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.008

心肌纤维化（Myocardial Fibrosis，MF）是以细胞外基质（ECM）过度聚集为特征的一种病理状态，是心室重构难以逆转的重要原因，可引起心脏收缩和舒张功能障碍，甚至恶性心律失常和猝死[1]。特异性蛋白1（Sp1）是一种细胞外基质蛋白，研究发现，Sp1相关通路Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1轴参与了心肌纤维化的病理过程，通过引发心肌细胞肥大，心肌成纤维细胞增殖，并大量转分化为肌成纤维细胞，促使ECM沉积的促进剂TGF-β1释放、ColⅠ增生，导致心肌纤维化的发生[2]。扶正化瘀胶囊是我国FDA批准的治疗肝纤维化药物，在临床上取得了良好的效果[3]，本课题组前期研究发现，其还能在一定程度上防治心肌纤维化，改善心功能，下调TGF-β1表达[4]，但其作用机制仍尚不明确。因此，本研究通过建立大鼠急性心梗纤维化模型，观察扶正化瘀胶囊对Sp1相关通路Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1轴的影响，进而研究其防治心肌纤维化的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年SD雄性大鼠，SPF级，30只，体质量（200±20） g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0006。分笼饲养于北京中医药大学东直门医院屏障动物实验室，昼夜节律，自由进食饮水。

1.1.2 药物 扶正化瘀胶囊（上海黄海制药有限责任公司，批号180606）。

1.1.2 试剂与仪器 RNAprep pure Tissue Kit、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix、SuperReal PreMix Plus（均购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP431，KR118-02，FP205-02）;HE染色液（北京九州柏林生物科技有限公司，货号：BLB-03，YH-102）、Masson染色液（南京建成科技有限公司，货号：D026-20）;Sp1抗体（Abcam公司，英国，货号：ab13370）、Gata4抗体（Abcam公司，美国，货号：ab134057）、转化生长因子TGF-β1抗体（Abcam公司，美国，货号：ab92486）、ColⅠ（Abcam公司，美国，货号：ab90395）、Tsp1（Abcam公司，美国，货号：ab1823）、β-actin（Abcam公司，美国，货号：ab8226）。动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司，ALC-V8型）;心电图机（CardiMax公司，日本，Fx-7202型）;千分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司，JA1003N型）;紫外分光光度计（Pharmacia Biotech公司，美国，Gene Quant型）;基因扩增仪（ABI公司，美国，GeneAmp PCR system 9700型）;实时荧光定量PCR仪（安捷伦科技公司，美国，Mx3000P型）;光学显微镜（Olympus公司，日本，BX53型）

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 根据文献建立大鼠急性心梗模型。大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后背位固定，气管插管后连接呼吸机，于左胸第3、4肋间横向打开1.5 cm左右，钝性分离肌肉，暴露心脏，以开胸器扩大手术视野，于动脉圆锥与左心耳之间下约2 mm处用5/0手术线对左冠状动脉前降支进行结扎，见到前壁组织迅速缺血变白后，于心脏表面滴0.1 mL利多卡因，立即关闭胸腔并逐层缝合，心电图显示ST段明显抬高[5]。假手术组只穿线不结扎。术后每只大鼠分别给予0.2 mL利多卡因和速尿，并连续3 d注射40 U青霉素预防感染。术后24 h将心电图没有ST段改变的造模大鼠剔除后，按照随机数字表法将剩余大鼠分为扶正化瘀胶囊组和模型组，假手术组作为对照，每组6只。

1.2.2 给药方法 扶正化瘀胶囊按0.4 g/（kg·d）体质量灌胃（相当于临床常用等效剂量），模型组和假手术组按5 mL/（kg·d）给予等体积去离子水，1次/d，共8周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 HE染色检测心肌组织病理学变化 心肌组织经常规脱水石蜡包埋后，制作3 μm切片。脱蜡至水后，胞核染10 min，将玻片放入盛有去离子水的免疫修复盒中洗去多余的染色液。1%盐酸酒精分化3 s，水中返蓝10 min，胞质染2 min，洗去多余液体1 min。脱水透明封片后，镜下观察梗死边缘区组织病理学变化（×400）。

1.2.3.2 Masson染色检测CVF 组织切片经脱蜡至水后，依次经过核染色、浆染色、分化及苯胺蓝复染后用无水乙醇冲洗，透明封片。采用Image-Pro Plus 6.0测算心肌胶原面积，CVF=胶原面积/（胶原面积+心肌面积）×100%，每张切片随机选取5个无重叠视野（×200），结果以均值表示。

1.2.3.3 qRT-PCR法检测Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1 mRNA表达 根据RNAprep pure Cell/Bacteria Kit试剂盒提取心肌梗死边缘区组织总RNA，紫外分光光度计测量OD260/OD280，并计算RNA的浓度。按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒进行反转录，并以cDNA为模板配制20 μL反应体系进行Real-time PCR。扩增条件为：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以β-actin为内参，所得CT值按照的2-△△CT方法进行均一化处理后再进行统计学分析。委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因引物的合成。引物序列如下：Sp1：上游5′-GGCAGACTAGCAGCAGCAATACC-3′，下游5′-AGGACAGTTGAGCAGCATTCACAG-3′;Gata4：上游5′-CAGCAGCAGCAGCAGTGAAGAG-3′，下游5′-AGAGCCGACAGCACTGGATGG-3′;TGF-β1：上游5′-GCAACAATTCCTGGCGTTACCTTG-3′，下游5′-TGTATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC-3′;ColⅠ：上游5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG-3′，下游5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCAC-3′;Tsp1：上游5′-GGCTTCATCTTCCTGGCTTCCTTG-3′，下游5′-GCTTCCTCCACTGACACCACTTG-3′;β-actin：上游：5′-TGTGAT GGACTCCGGAGACGG-3′，下游：5′-ACAGCTTC TCTTTGATGTCACGC-3′。

1.2.3.4 Western blot法检测Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1蛋白表达 按照Protein Extraction Kit试剂盒提取组织总蛋白。取60 μg蛋白样品100 ℃煮沸变性10 min后，经SDS-PAGE凝胶电泳，按照电流300 mA恒流转膜2 h至PVDF膜上。随后将PVDF膜浸泡于Milk Blocking Buffer中，摇床中轻摇1 h，加入抗体Sp1（1∶500）、Gata4（1∶500）、TGF-β1（1∶500）、ColⅠ（1∶500）、Tsp1（1∶500）4 ℃孵育过夜。洗膜后，孵育二抗（1∶5 000）。TBST冲洗，在ECL显色液中浸泡PVDF膜1 min，于暗室中进行曝光、显影并定影。以β-actin（1∶3 000）为内参，利用Quantity One v.4.6.2软件读取数据。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20统计软件对所得实验数据进行分析，结果以均数±标准差（±s）表示，其中符從正态分布的采用单因素方差分析，LSD法用于组间比较，不服从正态分布者用独立样本非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织HE染色结果 假手术组可见肌束紧密有序，胞核明显，形态规则。模型组可见典型的心肌梗死表现，心肌组织被破坏，心肌细胞破碎，细胞核固缩变形，失去原有的结构。扶正化瘀组纤维结缔组织减少，大部分胞膜相对完整。见图1。

2.2 各组大鼠心肌组织Masson染色结果及CVF比较 Masson染色可见胞质染成紫红色，胞核呈蓝紫色，胶原为蓝色。与假手术组比较，模型组大鼠CVF增加（P<0.01），胶原大量聚集，纤维化程度较重。与模型组比较，扶正化瘀组CVF减小（P<0.01），胶原相对减少，程度减轻。见图2、表1。

2.3 各组大鼠心肌组织Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1 mRNA表达比较 与假手术组比较，模型组TGF-β1、ColⅠ及Tsp1 mRNA表达均明显升高（P<0.05或P<0.01），Gata4 mRNA表达虽有上升趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较，扶正化瘀组Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1 mRNA表达均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见表2。

2.4 各组大鼠心肌组织Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1表达比较 与假手术组比较，模型组Sp1、Gata4、TGF-β1及ColⅠ表达升高（P<0.01），Tsp1蛋白表达降低（P<0.01）;与模型组比较，扶正化瘀组Gata4、ColⅠ表达降低（P<0.01），Sp1、TGF-β1蛋白表达呈降低趋势，Tsp1表达呈增高趋势，但均无统计学意义（P>0.05）。见图3、表3。

3 讨论

心肌梗死的晚期病理学改变中增生的纤维结缔组织会替代已坏死的组织，并以胶原沉积的形式影响心肌收缩舒张功能。其临床表现在中医学可解释为正气亏虚，血瘀阻络，当以益气活血化瘀为主，而扶正化瘀胶囊正是以此治则而立。在本实验中病理染色结果可见，扶正化瘀胶囊可降低CVF，减轻模型大鼠病理状态，与课题组前期研究发现相吻合[6-7]。

胶原即ECM框架结构的改变可导致纤维化的发生，其中ColⅠ的过度沉积在ECM异常聚集中具有重要作用。TGF-β1可促进ECM中胶原蛋白的合成并抑制其降解，是ECM沉积的促进剂[8]。模型组大鼠心肌组织TGF-β1、ColⅠ及其mRNA表达升高，扶正化瘀胶囊能抑制TGF-β1、ColⅠ及其mRNA的表达，提示扶正化瘀胶囊参与调节TGF-β1、ColⅠ表达减少ECM堆积。

特异性蛋白1（Sp1）相关通路Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1轴是新近发现的与纤维化疾病密切相关的潜在通路，通过调节Sp1和Gata4引发肥大反应，刺激引发心脏成纤维细胞增殖的可溶性因子TGF-β1释放，上调Tsp1并促进ColⅠ增生，参与ECM的动态调节过程[2]。其中，Sp1是一种细胞外基质蛋白，它可以信号依赖的方式直接与Gata4相互作用以调节基因的表达[9]。Gata4是可直接参与心肌肥厚调节的特定细胞核转录因子，是心肌细胞肥大和纤维化的指标[10]，通过加快ColⅠ沉积，促进心肌重塑[11]。Sp1还可直接与ColⅠ启动子结合[12]，或通过驱动TGF-β1间接激活胶原蛋白Ⅰ启动子进而促进ColⅠ表达[13]。存在于近端启动子中的重叠Egr-1和Sp1结合位点共同起作用可以正向调节小鼠Tsp1的组成型表达[14]。Tsp1是一种多功能的ECM糖蛋白[15]，可激活休眠型TGF-β1[16]，TGF-β1也能够增加其合成[17]，二者相互激活，并促进胶原蛋白增生及细胞凋亡等来影响心脏重塑[18]。本实验结果显示，模型组大鼠Sp1、Gata4及其mRNA、Tsp1 mRNA增加，提示Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1轴参与了心梗后左室重构的发生。与模型组比较，扶正化瘀胶囊能够下调心肌组织Sp1、Gata4表达以及Sp1、Gata4、Tsp1 mRNA的表达，提示其可通过调节Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1轴中Sp1、Gata4、Tsp1的表达，直接或间接减少TGF-β1及ECM胶原合成，改善心梗后心肌重构。

心肌纤维化是心脏重塑的重要病理改变，是心肌梗死患者预后的关键所在，因此预防和改善纤维化显得尤为重要。本实验结果表明，扶正化瘀胶囊通过降低Sp1、Gata4、Tsp1的表达，可抑制ECM胶原合成，降低CVF，减轻模型大鼠病理状态，在一定程度上改善心梗后心肌纤维化，其作用机制可能与Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1轴相关。

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（2019-10-10收稿 责任编辑：王明）