不同栽培措施对党参药材化学质量的影响
2016-11-19高石曼刘久石孙恬刘凤松景浩齐耀
高石曼+刘久石+孙恬+刘凤松+景浩+齐耀东+张本刚+刘海涛+肖培根
[摘要]研究不同栽培措施对党参药材化学成分的影响，为党参药材的合理种植提供参考依据。以甘肃省岷县党参药材规范化种植基地不同栽培措施种植的党参药材为材料，通过HPLC指纹图谱分析、党参炔苷和党参多糖的含量测定，对党参药材样品进行化学质量评价。结果显示不同栽培措施对党参药材的化学质量具有一定的影响，党参炔苷和党参多糖的含量差异明显。其中，按照党参炔苷含量的高低顺序为：不施用壮根灵>施用壮根灵，不打尖、搭架>不打尖、不搭架>打尖、搭架>打尖、不搭架；按照党参多糖含量的高低顺序为：不施用壮根灵>施用壮根灵，不打尖、搭架>不打尖、不搭架>打尖、不搭架>打尖、搭架。基于化学质量评价结果，不施用壮根灵、不打尖、搭架是种植党参药材较佳的栽培措施。
[关键词]党参； 栽培措施； 质量评价
[Abstract]To observe the influence of different cultivation measures on the chemical constituents of Codonopsis Radix and provide reference for its reasonable cultivation， Codonopsis Radix samples cultivated by different cultivation measures were collected from the planting base in Min county，and their quality were evaluated by establishing HPLC fingerprint and determining the content of lobetyolin and Codonopsis Radix polysaccharide. The results show that different cultivation measures have an effect on the quality of Codonopsis Radix and the contents of lobetyolin and Codonopsis Radix polysaccharide are obviously different. According to the content of lobetyolin， not using Zhuanggenling>using Zhuanggenling. While， not pinching， shelving>not pinching， not shelving>pinching， shelving>pinching， not shelving. According to the content of Codonopsis Radix polysaccharide， not using Zhuanggenling>using Zhuanggenling. While， not pinching， shelving>not pinching， not shelving>pinching， not shelving>pinching， shelving. Based on the chemical quality evaluation results， the appropriate cultivation measure of Codonopsis Radix is not using Zhuanggenling， not pinching and shelving.
[Key words]Codonopsis Radix； cultivation measure； chemical quality evaluation
doi：10.4268/cjcmm20162009
党参为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.、素花党参C. pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen或川党参C. tangshen Oliv.的干燥根，具有补中益气、生津养血、扶正祛邪的功效[1]。党参主要分布于华北、东北、西北地区，全国多数地区引种，以山西潞党和台党、甘肃纹党、四川晶党、陕西凤党最著名，为道地药材。通过文献查阅发现，影响党参药材产量及质量的主要因素有：土壤含水量、移栽、田间管理、农药及化肥施用、生长年限、采收期、加工方式等[2-11]。前期在对党参药材主产区的资源调查中发现，施用壮根灵、打尖、搭架等栽培措施会对党参药材的产量及质量产生一定的影响。因此，本研究通过设计施用壮根灵、打尖、搭架等不同栽培实验区考察不同栽培措施对党参药材化学质量的影响，应用高效液相色谱建立党参药材的HPLC指纹图谱，并对党参药材中与补益脾胃相关的活性成分党参炔苷的含量进行测定，另外采用紫外-可见分光光度法对党参药材中与抗肿瘤、增强免疫功能及抗氧化相关的活性成分党参多糖的含量进行测定，根据化学质量的评价结果，确定党参药材的最佳栽培种植技术，为党参药材的合理栽培种植和资源开发利用提供参考依据。
1 材料
Waters 2695-2996高效液相色谱系统（USA），Empower 2工作站，AL204电子分析天平（METTLER TOLEDO），KQ-300DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UV2550紫外分光光度仪（SHIMADZU，JAPAN），XMTD-6000水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）。乙腈为色谱纯（Honeywell，USA），超纯水（Milli-Q System，USA），甲醇、乙醇、硫酸为分析纯（北京化工厂），苯酚（天津市光复精细化工研究所）。党参炔苷（天津马克生物技术有限公司，纯度大于>98%，批号20151202），无水葡萄糖（中国食品药品检定研究院，批号110833-201205）。壮根灵（兰州义顺工贸有限公司）。
在甘肃省定西市岷县十里镇十里村党参药材规范化种植基地（34°29′ N， 103°57′ E，2 340 m），设计施用壮根灵、打尖、搭架等不同栽培措施实验区6个，每个小区设3个重复，每个小区面积66 m2，并设置中间保护行1 m。样品采集于2015年10月，共计18份，样品采集信息见表1，经中国医学科学院药用植物研究所张本刚研究员鉴定为桔梗科植物党参C. pilosula，凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所药用植物资源研究中心。
2 方法与结果
2.1 打尖、搭架的试验操作方法
2.1.1 打尖 打尖处理，在党参营养生长旺盛期，即7月中旬，对苗高35～40 cm的植株，在距地面15 cm左右处打尖，当藤蔓再次长到40 cm时，再打一次，共打尖2次，选择天晴、田间土壤干燥时按方案进行打尖。不打尖处理，与传统管理办法相同，任其自然生长。
2.1.2 搭架 搭架处理，用直径1 cm左右、长1.5 m左右的竹杆，每平方米按正三角形搭架。顶端用铁丝扎紧，下端插入土壤10 cm深左右。在苗高30～50 cm时，选择天晴、田间土壤干燥时按方案进行搭架。不搭架处理，与传统管理办法相同，任其自然生长。
2.2 提取工艺优选
在预试验的基础上，选择提取溶剂（A）、料液比（B）、超声时间（C）、超声次数（D）为考察因素，以党参炔苷提取量为指标，设计L9 （34）正交试验优化超声提取条件，其中因素水平见表2，试验安排及结果见表3，方差分析见表4。由直观分析可知，各因素对党参中党参炔苷的提取率的影响顺序为A>D>C>B，方差分析表明各因素对党参炔苷提取率的影响均无显著性差异。综合考虑，确定党参超声提取优化后的条件为70%甲醇超声提取，料液比为1∶30，超声2次，每次30 min。
2.3 HPLC指纹图谱分析
2.3.1 色谱条件 色谱柱 Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；进样量 10 μL；检测波长 267 nm；柱温 30 ℃；流速 0.8 mL·min-1；进样量 10 μL；流动相水（A）-乙腈（B），洗脱梯度：0～8 min，5% B，8～10 min，5%～8% B，10～25 min，8%～15% B，25～26 min，15%～20% B，26～36 min，20% B，36～48 min，20%～37% B，48～55 min，37%～60% B，55～70 min，60% B，70～80 min，60%～90% B，80～90 min，90% B。
2.3.2 对照品溶液的制备 取党参炔苷对照品适量，精密称定，加色谱甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，将对照品溶液保存于4 ℃冰箱中备用。
2.3.3 供试品溶液的制备 取党参药材样品细粉约1 g，精密称定，加70%甲醇30 mL，称重，超声2次，每次30 min，取出，放冷，称重，并用70%甲醇补足失重，滤过，取续滤液过0.22 μm滤膜，即得。
2.3.4 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液（S1）10 μL，连续进样6次，考察特征色谱峰保留时间和峰面积的一致性。各个特征色谱峰的保留时间和峰面积基本一致，与其共有模式图谱的相似度大于0.993，符合指纹图谱的要求。
2.3.5 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液（S1）10 μL，分别在0，4，8，12，24 h进行测定，以党参炔苷为观测指标，考察色谱峰保留时间和峰面积的一致性。各个特征色谱峰的保留时间和峰面积基本一致，与其共有模式图谱的相似度大于0.992， 表明在24 h内党参供试品溶液稳定性良好。
2.3.6 重复性试验 取同一供试品（S1）6份，精密称定，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，考察特征色谱峰保留时间和峰面积的一致性。各个特征色谱峰的保留时间和峰面积基本一致，与其共有模式图谱的相似度大于0.990，符合指纹图谱的要求。
2.3.7 指纹图谱的建立 按照2.3.1项下色谱条件，建立了18份党参药材样品的HPLC指纹图谱。采用国家药典委员会编写的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A 版）软件对图谱进行处理，生成共有模式的对照指纹图谱R，其中包括共有峰25个。通过与对照品比较，指认18号峰为党参炔苷，将其设为参照峰，标记为S。18份党参药材样品的共有模式的对照指纹图谱R 及HPLC 指纹图谱分别见图1，2。
2.3.8 相似度分析 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）软件对18份党参药材样品的指纹图谱数据进行处理，计算相似度，结果见表5。结果表明，18份党参药材样品之间的化学成分具有一定的差异性，即不同栽培措施对党参药材的化学质量具有一定影响。比较施用壮根灵对党参药材化学质量的影响，发现与对照指纹图谱R相比，壮根灵施用与否对党参药材整体化学成分的一致性影响不大。比较不同打尖、搭架栽培措施对党参药材化学质量的影响，发现与对照指纹图谱R相比，不打尖、不搭架和不打尖、搭架栽培的党参药材相似度最高，其次为打尖、不搭架栽培的党参药材，打尖、搭架栽培的党参药材相似度较低，以上说明打尖、搭架的栽培措施对党参药材整体化学成分的一致性影响较大，不同程度地影响党参药材质量的稳定性。
2.3.9 聚类分析 以18份党参药材样品作为研究对象，进行HPLC指纹图谱分析，获得25个共有色谱峰。以18号峰为参照峰，计算共有色谱峰的相对峰面积，运用SPSS 21软件对其进行聚类分析。经分析发现，施用壮根灵与未施用壮根灵的党参药材难以分开，说明两者整体化学成分的差异较小。对不同打尖、搭架栽培措施种植的12份党参药材样品进行聚类分析，结果见图3。12份党参药材样品可以分为2类，其中打尖、不搭架栽培的党参药材样品聚为一类，其余党参药材样品聚为一类。后者分为2类，即不打尖、不搭架栽培的党参药材样品聚为一类，其余党参药材样品聚为一类。聚类分析的结果表明，不同的打尖、搭架栽培措施种植的党参药材样品间化学成分差异较大，其中打尖、不搭架栽培的党参药材样品的化学成分与其他样品差异性最大，不打尖、搭架和打尖、搭架栽培的党参药材样品间化学成分的差异性最小。
2.4 党参炔苷的含量测定
2.4.1 线性关系 精密吸取党参炔苷对照品溶液2，4，6，8，10，15 μL，在2.3.1项的色谱条件下测定含量，记录色谱峰面积，以峰面积（Y）对进样量（X， μg）进行线性回归，所得回归方程为Y=643 575X-6 822.8，r=0.999 9，结果表明党参炔苷在0.08～0.60 μg线性关系良好。取党参炔苷对照品储备液，逐步稀释，在相同色谱条件下进样，测得党参炔苷的检测限为0.099 μg（S/N=3），定量限为0.331 μg（S/N=10）。
2.4.2 精密度试验 精密吸取同一份党参供试品溶液（S1）10 μL，连续进样6次，测得的党参炔苷峰面积的RSD 0.09%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验 取同一份党参样品（S1），共取6份，精密称定，分别按2.3.3项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，记录色谱数据。计算党参炔苷含量的RSD 0.57%，表明该方法重复性良好。
2.4.4 稳定性试验 精密吸取党参供试品溶液（S1）10 μL，分别在0，4，8，12，24 h进样测定，结果党参炔苷的峰面积RSD 0.19%，表明党参供试品溶液在室温下24 h内稳定。
2.4.5 加样回收率试验 称取已知含量的党参药材样品粉末1 g，精密称定，共取9份，分别加入高、中、低3种不同质量的党参炔苷对照品，精密加入70%甲醇溶液30 mL，称定质量，超声2次，每次30 min，取出，放冷，称重，并用70%甲醇补足失重，滤过，取续滤液过0.22 μm滤膜，即得。结果平均回收率在99.17%～101.1%，RSD 0.49%～1.1%，见表6。
2.4.6 样品测定 取不同批次的党参药材样品细粉1 g，精密称定，按上述色谱条件2.3.3项下制备党参供试品溶液，分别吸取10 μL进样，根据线性回归方程计算党参中党参炔苷的含量，结果见表7。
2.4.7 数据分析 将18份党参药材样品中党参炔苷的含量数据导入SPSS 21软件进行分析，得到不同栽培措施的党参药材样品中党参炔苷含量的均值及变异程度，见图4。方差结果表明，不同栽培措施的党参药材样品中党参炔苷的含量有显著性差异（P<0.05）。其中，不施用壮根灵>施用壮根灵，其含量差异具有显著性（P<0.05）；不打尖、搭架>不打尖、不搭架>打尖、搭架>打尖、不搭架，其中采用不打尖、搭架栽培措施种植的党参药材样品中党参炔苷的含量显著高于其余党参药材样品（P<0.05）。
2.5 党参多糖的含量测定
2.5.1 对照品溶液的制备 取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.11 mg的溶液，即得。
2.5.2 供试品溶液的制备 取60 ℃干燥至恒重的党参药材样品细粉约0.25 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150 mL，置水浴中加热回流1 h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加热回流1 h，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10 mL，合并滤液与洗液，放冷，转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取2 mL，定容至10 mL量瓶中，精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，再精密加硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出，置冰浴中冷却5 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在490 nm的波长处测定吸光度。
2.5.3 线性关系 精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，各加水补至1.0 mL，按照2.5.2项，自“精密加入5%苯酚溶液”开始操作，测定吸光度。以吸光度为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X， g·L-1），绘制标准曲线。所得回归方程为Y=87.341X+0.020 5，r=0.999 8，结果表明无水葡萄糖在0.022～0.110 mg线性关系良好。
2.5.4 精密度试验 精密吸取供试品（S1）1 mL置试管中，按照2.5.2项下，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起依法操作，冷却至室温后，将同一份反应液间隔0，4，8，12，24 h测定吸光度，连续测定6次，记录吸光度，结果RSD 0.16%，表明仪器精密度良好。
2.5.5 重复性试验 取党参药材（S1）样品细粉约0.25 g，精密称定，共6份，按照2.5.2项下操作，制备供试液，分别精密量取0.2 mL，置具塞试管中，按照2.5.2项下自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起依法操作，测定吸光度，结果RSD 0.22%，表明该方法重复性良好。
2.5.6 稳定性试验 精密吸取供试品（S1）1 mL置试管中，按照2.5.2项下，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起依法操作，冷却至室温后，将同一份反应液间隔0，4，8，12，24 h测定吸光度，结果RSD 0.82%，表明供试液在显色后的24 h内稳定。
2.5.7 加样回收试验 精密称取已知含量的同批样品（S1）细粉0.025 g，共6份，按2.5.2项下的步骤，醇沉后在药渣中各加入无水葡萄糖对照品粉末，制备供试品溶液，按照2.5.2项下自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起依法操作，测定吸光度，计算加样回收率，结果见表8。结果表明党参多糖的平均加样回收率在99.08%～100.3%，RSD 0.69%～1.3%，回收率结果良好。
2.5.8 党参多糖含量测定 取不同批次的党参药材样品细粉0.25 g，精密称定，按上述2.2.2项下制备供试品溶液，并根据线性回归方程计算党参多糖的含量，见表9。
2.5.9 数据分析 将18份党参药材样品中党参多糖含量数据导入SPSS 21软件进行分析，得到不同栽培措施的党参药材样品中党参多糖含量的均值及变异程度，见图5。结果表明，不同栽培措施的党参药材样品中党参多糖含量有显著性差异（P<0.05）。其中，不施用壮根灵>施用壮根灵，其含量差异具有显著性（P<0.05）；不打尖、搭架>不打尖、不搭架>打尖、不搭架>打尖、搭架，其中采用不打尖、搭架栽培措施种植的党参药材样品中党参多糖的含量显著高于其余党参药材样品（P<0.05）。
3 结论与讨论
提取方法的考察：比较了冷浸、热回流、超声3种提取方法。结果表明，超声提取可以得到相对丰富的色谱信息，且对党参炔苷的提取率更高，因此采用超声的提取方法。之后，设计L9 （34）正交试验优化超声提取条件，选择提取溶剂、料液比、超声时间、超声次数为考察因素，以党参炔苷提取量为指标，最终确定党参超声提取优化后的条件为70%甲醇超声提取，料液比为1∶30，超声2次，每次30 min。
色谱柱的选择：比较了Waters XBridge C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent ZORBAX SB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent Poroshell 120 SB-C18 （4.6 mm×100 mm，2.7 μm） 4种色谱柱对党参中化学成分的分离效果。对比4种色谱柱所形成的指纹图谱，前3种色谱柱所形成的色谱图的峰数差别较小，其中Waters XBridge C18色谱柱的色谱峰峰形和分离度更佳，可以得到更多的色谱信息。Agilent Poroshell 120 SB-C18相对前3种色谱柱出峰时间提前，但色谱峰峰形和分离度稍差，且基线波动较大，故选用Waters XBridge C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）。
流动相系统的选择：比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.1%乙酸水等作为流动相系统。结果发现以乙腈-水的梯度洗脱对党参中各种化学成分的分离效果较好，提供了丰富的色谱信息，故确定乙腈-水为流动相。
苯酚-硫酸法是多糖含量测定的经典方法之一。本实验对党参多糖的提取方法进行了线性关系、精密度、重复性、稳定性及加样回收率等的方法学考察，结果各项指标良好，因此该方法可用于党参多糖的含量测定。另外，本实验选用醇沉水提的方法提取党参多糖，与传统的水提醇沉方法相比，减少了精制多糖的步骤，可避免多糖在精制过程中的损失，使测定结果更加准确、真实，并减少了实验的工作量，提高了实验效率，适用于党参多糖的含量测定。
壮根灵是一种植物生长调节剂，在党参药材的栽培过程中使用较为普遍，其主要化学成分有氨基酸、五氧化二磷、氧化钾、微量元素等，通过抑制党参原植物茎叶的生长发育，控制其不结籽或少结籽，减少植物养分消耗，延缓叶片衰老，增强光合效率，从而促进地下根的生长，达到提高党参商品等级、增产创收的目的，一般于花蕾期喷施1～2次。打尖是通过减少地上部分的营养消耗，从而有利于地下部分养分的积累，一般于党参营养生长旺盛期，选择天晴、田间土壤干燥时进行。搭架的目的是使党参茎蔓攀援，以利通风透光，增强光合能力，促进苗壮苗旺，减少病虫害，防止因通风透光不良造成雨季烂秧，易染病害，影响参根与种子的产量，一般当参苗生长至合适的高度时，选择合适的方法搭架。
本研究通过设计施用壮根灵、打尖、搭架等不同栽培实验区获得相应的党参药材样品，以党参药材HPLC指纹图谱、党参炔苷含量和党参多糖含量为考察指标，研究了壮根灵的施用、打尖、搭架等栽培措施对于党参药材化学质量的影响，为制定党参药材的合理栽培种植技术提供了参考。研究表明，不同栽培措施种植的党参药材化学成分上具有一定的差异，其中，壮根灵施用与否对党参药材化学成分的整体性影响不大，但施用壮根灵的党参药材中党参炔苷和党参多糖的含量均明显下降，分析原因可能是由于壮根灵加速党参植物生长，导致其次生代谢产物的积累减少的缘故。比较打尖、搭架栽培措施对党参药材质量的影响，经过聚类分析，打尖、搭架，打尖、不搭架，不打尖、搭架和不打尖、不搭架4种栽培措施的党参药材样品可以很好地被分开，说明打尖、搭架等栽培措施对党参药材的化学质量具有一定的影响，其中，党参炔苷含量由高到低依次为不打尖、搭架>不打尖、不搭架>打尖、搭架>打尖、不搭架，党参多糖含量由高到低依次为不打尖、搭架>不打尖、不搭架>打尖、不搭架>打尖、搭架。由此可知，不打尖、搭架栽培措施种植的党参药材中党参炔苷、党参多糖含量均为最高，分析原因可能是由于打尖在一定程度上限制了党参植物光合作用的叶面积，使得根部有效成分的积累总量受到一定影响。综上所述，基于化学质量评价结果，较佳的栽培措施为：不施用壮根灵、不打尖、搭架。
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[责任编辑 吕冬梅]
