左勇，陈静，张晶，许努谦

1(四川师范大学 生命科学学院， 四川 成都， 610101)2(宜宾学院 质量管理与检验检测学部， 四川 宜宾， 644000)3(重庆大学 生物工程学院， 重庆， 400044)4(成都裕智果业有限公司，四川 成都， 610307)

桑椹果酒是以成熟桑椹鲜果为原料，经酵母发酵酿造而成，具有极高的营养价值和保健功效[1-3]。目前，对桑椹果酒的研究主要集中在菌种的选育、工艺的优化、营养和风味成分分析等方面，这有助于提升桑椹果酒的营养价值，利于消费者的身体健康[4-10]。然而，在桑椹果酒发酵过程中，普遍存在挥发酸较高的问题。挥发酸是桑椹果酒发酵过程中产生的副产物，其主要成分是乙酸，此外还有少量的甲酸、丙酸、丁酸等脂肪酸[11]。挥发酸是一类损害性物质，会带来尖酸感和不愉快的醋味，其含量过高会损害果酒的风味和口感。因此，控制桑椹果酒挥发酸含量对提升桑椹果酒品质具有重要意义。

目前，果酒挥发酸的研究主要集中在果酒专用酵母的选育、醋酸代谢途径的分析及发酵条件的优化[12-13]。VILELA等[14]从不同分离源中分离得到135株酵母，4株酵母能同时利用葡萄糖和醋酸，其中2株菌具有良好的发酵性能，将其进一步应用于不同浓度醋酸和乙醇环境中进行发酵，结果显示,2株菌均能较好降解醋酸[15]。VASSEROT等[16]对酿酒酵母醋酸代谢效果的研究发现，酵母对醋酸的代谢量随初始醋酸浓度的增加而增加，但当醋酸质量浓度超过1 g/L时，达不到降酸效果。因此，本研究通过优化发酵条件，即向桑椹发酵醪添加酶和金属离子，研究其对挥发酸的影响，并分析不同发酵条件桑椹果酒的品质，以期在控制挥发酸的同时，提升果酒品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑椹,产自四川，酸度为3.3～3.5 g/L，糖度约为10 °Bx；活性干酵母,购于安琪酵母股份有限公司。

LB20T型手持糖度计，成都格纳丝商贸有限公司；STARTER，2C型pH计，奥豪斯仪器(上海)有限公司；HH-S型恒温水浴锅，江苏省金坛市正基仪器有限公司；BT125D型分析天平，上海精密科学仪器有限公司；T6型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；GZ-250-HS11型恒温恒湿箱，韶关市广智科技设备有限公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；日立L-8800型全自动氨基酸分析仪，日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

桑椹果酒的制作工艺流程如下：

桑椹果实→破碎打浆→成分调整(添加白砂糖、调酸)→主发酵→分离→后发酵→初滤→调整→陈酿→澄清→精滤→装瓶→杀菌[17]

操作要点[18]：将桑椹破碎打浆得桑椹汁，添加白砂糖、柠檬酸以调整果醪糖度和酸度; 按比例接入酵母种子液于桑椹果醪中，将发酵醪置于一定温度下发酵7 d，发酵过程中进行搅拌以便完全发酵;发酵结束时进行倒罐，并根据果醪糖度和酒精度，补加白砂糖，封罐进入后发酵，发酵8～10 d至残糖质量浓度<4 g /L;经后发酵的桑椹果酒密封陈酿3～6个月; 陈酿结束后，桑椹果酒经板框过滤机过滤、装瓶并进行巴氏灭菌。

1.2.2 桑椹果醪成分调整及接种发酵

桑椹果酒常规发酵条件为调节发酵醪糖质量浓度为150 g/L，并按1 g/L的量加入柠檬酸以调节发酵醪酸度，酵母接种量为2 g/L，发酵醪于26 ℃发酵7 d。

1.2.3 酶对桑椹果酒挥发酸的影响[19]

1.2.3.1 酶添加时间对桑椹果酒挥发酸的影响

在桑椹果酒发酵前4 d，每天以0.2%(体积分数)的添加量向发酵醪分别加入单一酶制剂(果胶酶、纤维素酶和糖化酶)，同时以不添加酶的试验组作为对照。发酵结束时分析桑椹果酒中挥发酸和酒精含量。

1.2.3.2 酶添加量对桑椹果酒挥发酸的影响

向发酵醪分别添加不同体积分数(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%)的单一酶制剂(果胶酶、纤维素酶和糖化酶)，同时以不添加酶的试验组作为对照,发酵结束时分析桑椹果酒挥发酸和酒精含量。

1.2.3.3 复合酶对桑椹果酒挥发酸的影响

根据各种酶的最适添加量，分别向发酵醪加入单一酶和复合酶制剂(分别为：果胶酶、纤维素酶、糖化酶、果胶酶+纤维素酶、果胶酶+糖化酶、纤维素+糖化酶、果胶酶+纤维素酶+糖化酶)，同时以不添加酶的试验组作为对照,发酵结束时分析桑椹果酒挥发酸含量。

1.2.4 金属离子对桑椹果酒挥发酸的影响[20]

分别向桑椹发酵醪添加不同浓度(1、2、3、4、5 mmol/L)Zn2+、K+、Mg2+和Ca2+，以不添加金属离子的试验组作为对照，发酵结束时分析桑椹果酒挥发酸和酒精含量。

1.2.5 不同外源添加物对桑椹果酒品质的影响

在前期研究基础上，分别向发酵醪添加复合酶(0.05%果胶酶、0.1%纤维素酶、0.05%糖化酶)和Mg2+，同时以不添加外源物质的常规发酵试验组作为对照。发酵结束时对桑椹果酒的主要理化指标、氨基酸、挥发性风味成分进行分析、评价。

1.2.6 主要理化指标分析

挥发酸、总酸、总糖参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定[21]；酒精度采用分光光度法[22]；挥发性风味成分参照张晶等[23]桑椹果酒挥发性风味成分的检测方法。

1.2.7 游离氨基酸

游离氨基酸样品前处理参照李俊芳等[24]的处理方法。取适量桑椹果酒置于密封袋超声20 min，精确称取1 g样品，加入4%(体积分数)磺基水杨酸25 mL、过夜、10 000 r/min离心15 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，上机待测。

游离氨基酸由全自动氨基酸分析仪检测，其条件为：流速0.40 mL/min(pump1)，0.35 mL/min(pump2)；检测波长570、 440 nm；柱温135 ℃(反应柱)、57 ℃(分离柱)；进样体积20 μL；游离氨基酸含量由仪器自带程序计算。

2 结果与分析

2.1 酶添加时间对桑椹果酒挥发酸的影响

由于发酵醪中多糖类大分子物质的存在，酵母不能直接利用，正常的酒精发酵受阻，易产生挥发酸等副产物，从而损害果酒的品质[25]。为降解桑椹发酵醪中多糖类物质，从桑椹果酒发酵0～4 d，分别向发酵醪液中加入果胶酶、纤维素酶和糖化酶，探究其对桑椹果酒挥发酸的影响，结果如图1所示。

图1 酶添加时间对桑椹果酒挥发酸的影响Fig.1 Effect of addition time of enzyme on volatile acidity of mulberry wine

由图1可知，桑椹果酒发酵前2 d加入酶制剂，挥发酸含量均有不同程度的降低，表明加入酶制剂对挥发酸有较好的控制效果。且果胶酶和纤维素酶加入时间越早，挥发酸含量越低，其最佳添加时间为发酵第0天，挥发酸含量分别降低12.8%、10.1%。而糖化酶的最佳添加时间为发酵第2天，挥发酸含量降低6.0%。

2.2 酶添加量对桑椹果酒挥发酸的影响

水果中普遍含有丰富的果胶、纤维素、淀粉等多糖类物质。多糖类大分子物质易造成果醪浑浊、不均一，影响正常的酒精发酵，导致挥发酸、高级醇等副产物的产生，进而损害果酒的品质。果酒生产中，通常会用果胶酶、纤维素酶和糖化酶进行酶解处理[26]，其中果胶酶、纤维素酶可以快速彻底地降解果胶、纤维素等物质，降低果汁黏度，改善果汁成分，使果汁澄清透亮[27]；糖化酶能将淀粉类物质降解为葡萄糖等易于被酵母利用的小分子物质。本次试验分别研究了单一酶和复合酶对果酒挥发酸的影响。

2.2.1 单一酶对桑椹果酒挥发酸和酒精含量的影响

果胶酶、纤维素酶及糖化酶对桑椹果酒挥发酸和酒精含量的研究结果如图2所示。

由图2-a可知，随着果胶酶的增加，桑椹果酒中挥发酸含量大致呈先降低后升高的变化趋势，酒精含量先升高后降低。当添加果胶酶体积分数为0.05%时，挥发酸含量最低，为0.57 g/L，比不添加果胶酶时降低了13.7%。通过向桑椹发酵醪中加入果胶酶，桑椹果胶物质被降解，这一方面改善了果醪中的物质分布，另一方面降低了发酵醪的黏稠度，增加果醪的流动性，有利于酵母发挥正常的发酵性能，从而促进酒精发酵，控制了挥发酸的形成[28]。

随着纤维素酶的增加，桑椹果酒中挥发酸含量先降低后升高，酒精含量大体呈逐渐上升的趋势(图2-b)。当添加纤维素酶体积分数为0.1%时，挥发酸含量最低，且酒精含量达到最高。这可能是由于纤维素酶的加入，细胞壁破裂，纤维素被降解为葡萄糖等小分子物质，细胞内物质也随之浸出，这不仅增加了发酵底物，也降低了果醪黏度，使整个发酵体系更适于酵母的繁殖、代谢，有利于反应向酒精生成的方向进行，同时也有效控制了挥发酸的生成[29]。

由图2-c可知，随着糖化酶的增加，桑椹果酒中挥发酸含量呈先降低后上升的变化趋势，酒精含量先升高后降低。当添加糖化酶体积分数为0.05%时，挥发酸含量最低，为0.60 g/L，比不添加糖化酶时降低了10.3%。这可能是由于糖化酶可以将多糖转化为可被酵母直接利用的葡萄糖[30]，有利于正常的酒精发酵，同时降低了挥发酸等副产物的生成。

2.2.2 复合酶对桑椹果酒挥发酸的影响

由图3可知，在桑椹果酒发酵过程中，同时添加3种酶对挥发酸的控制效果最好，优于2种酶和单一酶，其挥发酸含量比不添加酶的试验组降低15.3%。

a-添加果胶酶；b-添加纤维末酶；c-添加糖化酶图2 酶添加量对桑椹果酒挥发酸的影响Fig.2 Effect of addition content of enzyme on volatile acidity of mulberry wine

在桑椹中，果胶和纤维素构成相邻细胞中间层黏结物，使组织细胞紧紧黏结在一起[31]。由果胶酶、纤维素酶和糖化酶组成的复合酶会对桑椹果实细胞壁产生更大的破坏作用，对细胞壁的降解作用更好，使果胶和纤维素等物质被降解为葡萄糖等小分子化合物，而细胞内的多糖类物质也随着细胞的破裂浸出，被糖化酶进一步降解，这都有利于酵母对发酵底物的利用，同时由于复合酶的加入，提高了出汁率，使发酵醪澄清、均匀，更利于酒精发酵的进行。

图3 复合酶对桑椹果酒挥发酸的影响Fig.3 Effect of component enzyme preparation on volatile acidity in mulberry fruit注：果,代表果果胶酶；纤,代表纤维末酶；糖,代表糖化酶

2.3 金属离子对桑椹果酒挥发酸的影响

微生物正常的生长、繁殖和代谢需要外界提供充足的营养物质，其中无机盐(金属离子)是重要的营养要素。金属离子在微生物体内的作用广泛，如构成细胞内一般分子成分；作为酶的组成成分及其激活剂或抑制剂；调节发酵环境的渗透压、pH值、氧化还原电位等。本次试验研究了金属离子对桑椹果酒挥发酸的影响。

2.3.1 金属离子对桑椹果酒挥发酸的影响

由图4可知，向桑椹发酵醪中添加Zn2+、K+、Mg2+均有利于挥发酸的控制。随着金属离子浓度的增加，挥发酸含量呈先降低后升高的变化趋势。当Zn2+、K+、Mg2+浓度分别为2、 2、 4 mmol/L时，挥发酸质量浓度最低，分别为0.68、0.69、0.65 g/L。这可能是由于Zn2+参与构成乙醇脱氢酶的活性中心，对酶蛋白结构的稳定起到重要的作用，适量的Zn2+有利于乙醇脱氢酶发挥活性，使酒精发酵更好的进行，同时也减少挥发酸等副产物的生成[32]；K+对维持细胞内外渗透压起着重要的作用[33]；Mg2+是微生物体内多种酶的激活剂，适量浓度的Mg2+能激活糖酵解途径相关酶活性，促进酵母代谢的正常进行，而过量的Mg2+会抑制酵母的生长，出现发酵迟缓，不利于酒精发酵[34]。当加入Ca2+时，桑椹果酒挥发酸含量随着Ca2+浓度的增加逐渐升高。可能是由于Ca2+的加入，改变了挥发酸代谢途径中相关酶的活性，乙醛脱氢酶活性提高，使醋酸合成量增加，另一方面乙酰辅酶A合成酶活性降低，使乙酸代谢途径反应受阻，从而引起挥发酸的升高[35]。

图4 金属离子对桑椹果酒挥发酸的影响Fig.4 Effect of metal ions on volatile acidity of mulberry fruit

2.3.2 金属离子对桑椹果酒酒精含量的影响

由图5可知，向桑椹发酵醪中添加Zn2+、K+、Mg2+均有利于酒精的生成。当Zn2+、K+浓度为2 mmol/L时，酒精度达到最高，为7.5%vol。Mg2+的最适浓度为4 mmol/L，其酒精度为7.4%vol。当加入Ca2+时，桑椹果酒酒精含量随着Ca2+浓度的增加逐渐减低。这可能是由于金属离子的加入，调节了桑椹果醪的发酵环境，使反应向有利于酒精生成的方向进行，同时减少发酵副产物的生成。

图5 金属离子对桑椹果酒酒精含量的影响Fig.5 Effect of metal ions on alcohol of mulberry fruit

2.4 不同外源添加物对桑椹果酒品质的影响

2.4.1 主要理化指标

桑椹果酒主要理化指标如表1所示。

表1 桑椹果酒主要理化指标Table 1 Main physical and chemical indexes of mulberry wine

由表1可知，以上3种桑椹果酒挥发酸均低于行业标准规定的1.5 g/L，总酸为4～9 g/L，酒精度为7%vol～18%vol，残糖含量低于干型桑椹果酒规定的4 g/L，表明3种条件下酿造的桑椹果酒均能达到行业标准要求，其中，添加复合酶的桑椹果酒挥发酸含量最低，酒精度最高。

2.4.2 游离氨基酸

游离氨基酸可呈现酸、甜、苦、涩、鲜等味道，赋予果酒丰富的味觉层次，其组成和含量能够部分反映桑椹果酒的营养价值。由表2可知，从桑椹果酒中共检测出17种氨基酸，甜味氨基酸有苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸；鲜味氨基酸有谷氨酸；酸味氨基酸有天冬氨酸；苦味氨基酸有半胱氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和酪氨酸；涩味氨基酸有缬氨酸和亮氨酸。3种果酒氨基酸呈味均以甜味为主，鲜味和苦味次之，涩味再次之，酸味最弱。果酒中谷氨酸、络氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量均较高，其中，甘氨酸不仅能提供清甜味，还能减少苦味。不同果酒中，各种氨基酸含量以及氨基酸总量均呈现较大差异。总体上看，添加复合酶的桑椹果酒游离氨基酸总量高于其他2种桑椹果酒。

表2 桑椹果酒游离氨基酸 单位：mg/L

2.4.3 挥发性风味成分

桑椹果酒挥发性风味成分离子流图谱如图6所示，其相对百分含量如表3所示。

图6 桑椹果酒挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of volatile flavor components of mulberry wine

表3 桑椹果酒挥发性风味成分 单位：%

挥发性风味成分的种类和含量会影响桑椹果酒的品质，是评价桑椹果酒内在品质的一项重要指标。由表3可知，从常规发酵条件、添加复合酶和添加Mg2+的桑椹果酒中分别检测到28、33、23种挥发性风味成分，其中醇类和酯类占总量的90%以上，是桑椹果酒中最主要的挥发性风味成分。添加复合酶的桑椹果酒挥发性风味成分最丰富，其醇类和酯类的种类也高于其他2种条件下发酵的果酒，这可能是由于复合酶的添加促进了桑椹大分子物质的降解，发酵醪中物质间相互作用，形成良好的发酵环境，更有利于风味物质的形成。

3 结论

酶制剂和金属离子均有助于桑椹果酒挥发酸的控制，果胶酶和纤维素酶的最佳添加时间为发酵第0天，最适添加量分别为0.05%、0.1%(体积分数)；糖化酶的最佳添加时间为发酵第2天，最适添加量为0.05%(体积分数)；Zn2+、Mg2+、K+的最适添加量分别为2、4、2 mmol/L。添加复合酶(0.05%果胶酶、0.1%纤维素酶、0.05%糖化酶)时挥发酸含量最低，其含量比不添加酶制剂降低15.3%。在添加不同外源物质的桑椹果酒中，添加复合酶的桑椹果酒挥发酸含量最低(0.66 g/L)，游离氨基酸含量最高(532.11 mg/L)，挥发性风味成分最丰富(33种)，既有效控制了桑椹果酒挥发酸含量，又保证了桑椹果酒优良的品质。本研究为桑椹果酒挥发酸的控制提供了理论依据，不仅有利于降低桑椹果酒挥发酸，促进品质提升，同时也为其他果酒挥发酸的控制提供解决方案。