朱孝霖，徐珂盼，罗雯，王怡，赵希岳，蔡志强*

常州大学药学院（常州 213164）

果胶是一种天然复杂的糖类聚合物，在化学中，果胶被定义为是由α-1, 4共价键连接半乳糖醛酸单元组成的一种阴离子多糖。植物组织中的果胶常与纤维素或半纤维素等其他成分共价结合组成植物细胞壁，在植物的生长发育中发挥重要作用[1]。果胶常被用于酸奶制品、面包馅料，作为胶凝剂用于果酱、果冻。果胶按形态可划分为3种，即果胶、原果胶和果胶酸[2]。

果胶酶属于水解酶的一种，用于分解果胶物质，广泛存在于高等植物和微生物中。在纺织、造纸、医药工业、废水处理、动物饲料生产及原生质体融合等诸多领域应用广泛[3]，特别地在果酒酿造中具有提高出汁率、加速澄清等重要作用，由于果胶酶进口较多，不仅增加生产成本，也使我国果酒生产技术受到制约，因此，自主研发出具有知识产权的果胶酶是目前各个行业中亟待解决的问题[4]。果胶酶分类方法较多，一般可以分为原果胶酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶[5]。Amin等[6]预计到2021年，果胶酶市场规模可达3 550万美元，而现有研究大多以微生物为主，也正是由于微生物生长条件简单，生产酶周期短，而且具有产量高、效率高、酶活好等优点，因此也是工业产酶的首选。

随着生物技术的进步，果胶酶的研究在工艺优化、分离纯化、酶学性质、结构生物学和分子生物学等方面取得突破性进展[6]，也在尽可能满足我们对果胶酶日益增长的需求量，因此，着重对产果胶酶菌株筛选、诱变、生物合成、固定化果胶酶内容进行综述，对果胶酶广阔前景进行展望，为商业规模化应用、拓展全新应用领域提供理论依据。

1 微生物果胶酶的研究

1.1 产果胶酶菌株的筛选

微生物是产果胶酶的重要来源，是否有高的果胶酶活，菌株的品质好坏是直接原因，因此近年来研究者在生产果胶酶的菌种选育方面也花费大量精力，其中从大自然筛选优质的野生菌株便是最常规的方法[7]。

Anju等[8]首次报道索诺芽孢杆菌生产果胶酶，从腐烂的水果和蔬菜中用碘液显色方法从果胶琼脂平板筛选出的7株果胶酶产生菌中，进一步确定索诺芽孢杆菌为最高效的菌株MPTD1，经液体深层发酵优化后最大酶活为2.43 U/mL。Akinyemi等[9]从尼日利亚拉各斯泻湖中的腐烂木屑中分离出巨大芽孢杆菌、巴达维亚芽孢杆菌和拟芽孢杆菌，经深层发酵以果胶为底物，进行产果胶酶能力筛选，研究表明与其他2株筛选菌相比，拟芽孢杆菌产果胶酶活力最高。Saifur等[10]从韩国发酵食品泡菜中分离出产强碱的碱性果胶酶PNs31的枯草芽孢杆菌CBS31，使用碘-碘化钾溶液染色、NaCl脱色方法进行筛选。罗群等[11]使用刚果红染色、NaCl溶液脱色方法，筛选出透明圈/菌落直径比值较大的高产果胶酶的黑曲霉。姜立春等[12]从腐烂水果中分离到1株产果胶酶的黄曲霉，使用果胶作为唯一碳源，结合卢戈氏碘液染色、生理盐水脱色方法进行筛选。有研究通过溴酚蓝法根据透明圈大小判定果胶酶活的大小，进而筛选出高产果胶酶的菌株；通过添加一定量CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），依据水解圈的大小来筛选高产果胶酶的菌株[5,11]。

1.2 产果胶酶菌株的常规育种

除了从大自然中筛选野生菌株生产果胶酶，将原始菌株经紫外诱变、化学诱变、脉冲等多种单一或者复合方法进行改变，获得正向突变菌株，也是提高果胶酶酶活最常见的策略[12-13]。

车鑫[14]以Aspergillus terreusgxy12-2为出发菌株，通过紫外诱变中的辐射将能量传递到生物体内，使得生物体内各种分子发生电离、激发产生大量化学性质十分活跃的自由原子或自由基团，结合亚硝基胍诱变中烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化，导致DNA复制时碱基配对错误引起突变，从而筛选到A.terreusZH2-4和A.terreusZH2-11两个正向突变菌株，与原始出发菌株相比，其诱变菌获得的酸性果胶酶酶活分别提高到原来的1.45倍和1.02倍。张佰清等[15]通过脉冲方法诱变黑曲霉，获取了高产果胶酶的正向突变菌株L9，与原始菌株相比，其果胶酶活力提高到182.22%±0.18%，可达192.67 U/mL。杜国军等[16]也是采用复合诱变方法，即亚硝酸-紫外对黑曲霉HY-D3处理，获得突变株HY-LL3，经过固态发酵优化，果胶酶酶活高达到3 124 U/g，与原始菌株相比，提高2.59倍。Rohena等[17]以黑曲霉YQ-13为出发菌株，结合紫外与氯化锂复合诱变反复处理，使用碘液染色方法进行初筛，依据产酶能力进行复筛，最终获得1株能够稳定遗传的正向突变菌株，其果胶酶活力为67.6 U/mL，比出发菌株提高2.44倍，经过响应面优化，果胶酶活力提高至92.1 U/mL。何海燕等[18]利用微波照射方法处理棘孢曲霉D80菌株，获得1株正突变菌株DW75，与出发菌株D80相比，酶活提高2.47倍。由此可见菌株的常规诱变育种是一种有效提高果胶酶活力的普遍手段。

1.3 产果胶酶菌株的基因工程

除了通过常规的诱变菌株获取正突变菌株来提高果胶酶生产，国内外研究学者还对果胶酶的分子生物学方面进行探究，从编码果胶酶的基因入手，进行克隆、纯化、高效表达等多种基因工程手段来进一步提高果胶酶酶活。

Rajulapati等[19]克隆耐热梭状芽孢杆菌来源的果胶甲酯酶基因至pET-28a，以大肠杆菌BL21为表达菌株，并添加异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷诱导重组蛋白表达，对其氨基酸序列进行分析，结果表明它与菊花欧文菌来源的果胶甲酯酶有38%同源性，而且重组Ct PME以可溶性蛋白形式表达，在SDS-PAGE凝胶上显示1条分子量约35.2 kDa的单条带，并结合最先进、最准确的方法MALDI-TOF MS分析其分子量，结果与凝胶显示一致。刘晓肖等[20]以全基因合成的类芽孢杆菌来源的碱性果胶裂解酶基因为模版，设计引物经PCR扩增得到含预测的信号肽及不含预测信号肽的果胶酶基因，并在毕赤酵母GS115中分泌表达，自身预测信号肽PF的使用使得甲醇诱导144 h时酶活提高111.66%，又在PF信号肽基础上对启动子进行改造，使得酶活进一步提高51.47%，达到89.65 U/mL。Zhang等[21]克隆黑曲霉ZJ5果胶甲酯酶基因pME-zj5a，并成功在毕赤酵母中进行高效异源表达，且PMEZJ5A与CaCl2配合使用会提高菠萝硬度。Zhong等[22]克隆筛选出的木质拟杆菌果胶甲基酯酶基因，并在大肠杆菌中进行异源表达，且PxPME与CaCl2复合使用会将菠萝块的硬度提高114%。何玉兰等[23]从黑曲霉来源的果胶裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD、pelF）中成功筛选并克隆出2个高表达基因pelA和pelD，及相应黑曲霉转化菌株SH2-PelA和SH2-PelD，并对转化菌株进行发酵产酶工艺研究，结果表明在摇瓶发酵条件下最高酶活力分别为11 069.2和8 822.6 U/mL，在液体深层发酵条件下最高酶活力分别为65 148.8和35 670.0 U/mL，分别比摇瓶发酵酶活提高5.9倍和4.0倍，研究表明重组菌株的工业化大量生产酸性果胶裂解酶潜力。Sharma等[24]以农业废弃物为底物，获得碱性木聚糖酶活力415.22±18.50 IU/mL，碱性果胶酶活力为109.10±8.80 IU/mL，这也是首次提出在短发酵周期下，优化液体发酵条件，在接种物中利用木聚糖和果胶的粗提同时提高两种碱性酶活性的方法。中国农业科学院饲料研究院首次报道从草酸青霉SX6中鉴定具有独立催化结构域，新的28家族双功能果胶酶，具有果胶甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶活性，与大多数真菌果胶甲酯酶相比，S6A对70% DM柑橘果胶具有较高的比活力（271.1 U/mg）[25-27]。综上所述，基因工程改造是提高微生物所产果胶酶活的有效方法。

2 果胶酶固定化研究

生物酶一般都具有高催化活性、强底物专一性和对环境无污染的优点，如果果胶酶直接加入到工厂生产中，就很难再回收利用，所以在一定程度上提高生产成本。因此有研究通过探究固定化酶技术以提高回收利用率[28]。酶的固定化技术是通过物理或化学方法将游离酶和相应载体结合，从而增强酶的稳定性，加强保存运输；同时又能将酶与底物分离，达到重复利用、降低成本的目的。常用的物理方法有吸附法、包埋法等；化学方法有共价键结合法、交联法等。

Haneef等[29]为提高酶的催化性能，采用聚丙烯酰胺凝胶包埋的方法对果胶酶进行固定化，结果表明该方法不仅提高果胶酶的热稳定性，而且也提高果胶酶在各行各业中重复利用的可能性，即使经过7次反应，果胶酶仍保持50%以上的初始活力。Saifur等[10]为提高分离菌株所产果胶酶应用的稳定性，将果胶酶

PNs31固定在海藻酸钙珠中，且研究结果表明固定化酶在第2轮和第3轮的重复使用试验中分别保持约83%和65%的相对活性。赵岩等经过扫描电镜和红外光谱验证果胶裂解酶PpPel10a被成功固定化，研究采用壳聚糖-戊二醛交联法对重组PpPel10a进行固定化，经过优化固定材料参数，确定壳聚糖浓度、戊二醛浓度及酶浓度分别为3%，4%和0.8 mg/g时，固定化酶的活性达到最高值，固定化率达87.3%，且结果表明固定化酶具有更宽的温度和pH稳定性范围。Papadaki等[28]固定化果胶酶的制备是通过包埋交联法并结合超声波作用，其研究结果表明在超声波条件下果胶酶活性提高92.28%。漆丹萍等[30]研究发现在HPD-750树脂上固定果胶酶后，仍得到相较游离果胶酶更广泛的pH适用范围和更好的热稳定性，并且此固定化酶可以重复使用10次左右，提高酶的回收利用，降低生产成本。

3 结语与展望

生物类型催化剂是最绿色环保型的工业催化剂，而果胶酶因其良好性能而极具吸引力。自然界中的极端微生物因其广泛的应用类别而非常适合工业应用，农用工业副产品是一个好的底物选择[30]，固态发酵等发酵过程也是最可靠的。随着生物技术的不断进步，结合果胶酶研究现状，对生物合成果胶酶方面进行深入探究，这无疑对工业生物技术领域来说是一个福音，因此仍需在以下几点有所侧重：

（1）如何通过有效的基因工程手段改造果胶酶的生产菌株。

（2）如何通过固定化技术高效结合果胶酶和载体，进而提高其回收利用率，并根据载体材料的不同，拓展果胶酶的全新应用领域。

（3）改进发酵工艺，高效提升果胶酶酶活，降低生产成本。

因此，我们应继续深入研究果胶酶的一系列课题，为拓展其工业应用价值奠定基础。