沈兴旺，李婉麒，赵创谦，崔鑫儒，陈紫颖，汤柳茜，张汇，熊智强，艾连中，夏永军

(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

牦牛常年生活在海拨3 000 m以上的高寒地带，采食天然牧草，当地空气、水源、草场均未受污染，因此所产牛奶是纯天然的绿色食品，被誉为“天然绿色浓缩奶”[1]。发酵乳是由鲜乳经乳酸菌发酵而成，不仅改善了营养品质，还产生了生物活性物质，具有较好的益生功能[2]。牦牛发酵乳有益于消化，可以治疗轻微腹泻，还有抑菌、镇静的功能，其营养价值高于普通牛奶，是一款潜在的保健饮料。过去牦牛乳产品加工标准缺失，牦牛酸奶的加工一直停留在初级阶段[3]，在实际生产、运输等环节，牦牛发酵乳普遍存在因为凝胶脆弱导致组织状态破坏及乳清析出等问题，严重影响了牦牛发酵乳的品质。

益生菌可改善体内微生物菌群平衡，对宿主健康产生积极作用。发酵乳被认为是将益生菌传递到人体内的最理想载体，发酵乳添加益生菌后，他们之间保健作用和营养价值互相交织在一起，可完美结合起来。本研究所采用的益生菌菌种为实验室自行筛选得到，并且具有优良的生理活性，LactobacillusplantarumAR501具有优良的抗氧化活性，能够显著缓解煎炸油引起的肝脏氧化应激损伤[4-5]；LactobacillusplantarumAR495具有缓解骨质疏松功能，并具有较好的胞多糖合成能力；LactobacillussalivariusAR809具有防龋齿，缓解细菌性咽炎的活性，并具有较好的胞多糖合成能力[6]。本研究主要探讨添加益生菌株对发酵乳发酵过程中理化性质、质构、流变学特性及感官品质的影响[7]，为开展高品质牦牛发酵乳的研究和提升青藏高原牦牛产业发展提供一定理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牦牛乳，青海高原之宝牦牛乳业有限公司；植物乳杆菌L.plantarumAR501(保藏编号CGMCC 13910)、植物乳杆菌L.plantarumAR495(保藏编号CGMCC 14004)、唾液乳杆菌L.salivariusAR809(保藏编号CGMCC 17206)，-80 ℃冻存管保存；普通酸奶发酵剂YO-MIX 883(保加利亚乳杆菌Lactobacillusbulgaricus、嗜热链球菌Streptococcusthermophiles)，丹尼斯克(中国)有限公司；改良MRS培养基(g/L)：牛肉浸出粉10、酪蛋白胨10、酵母浸出粉5、葡萄糖20、三水乙酸钠8.3、柠檬酸氢二胺2、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·H2O 0.25、吐温-80 1；ZnSO4、NaNO3、K2HPO4·3H2O、ZnSO4、CaCl2、HCl、三氯乙酸、NaCl、H2SO4、磷钨酸、无水Na2SO4、KOH、NH4HCO3(均为分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；白砂糖，南京甘汁园糖业。

1.2 仪器与设备

3-18K型冷冻离心机, 德国Sigma公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化；KBF240型恒温恒湿培养箱，德国Binder公司；PB-10型pH计，瑞士梅特勒-托利多公司；FOSS 8400全自动凯氏定氮仪，瑞典FOSS分析仪器有限公司；WNB7-45型快速升温水浴锅，德国Memmert有限公司；PL2002型电子天平，瑞士Metrler Toledo公司；LDZF-30KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安；TA.XTPlus物性测试仪，英国Stable Micro System公司；DHR-3旋转流变仪，美国TA仪器；APV100高压均质机，丹麦APV 公司；BCD-278TAJ型冰箱，海尔集团公司。

1.3 试验方法

菌株培养：将菌株从-80 ℃取出，菌种继代于MRS液体培养基中培养生长，接种量为1%。

酸奶制备：新鲜牛乳，加入质量分数为7%的白砂糖，42 ℃搅拌水合，均质机均质，巴氏杀菌，冷却至42 ℃，接种量为2%，42 ℃培养，4 ℃冷藏，破乳。

酸度测定：采用滴定酸度法，以吉尔涅尔度(°T)表示[8]。

持水力测定：参照刘亚琼等[9]的方法，将离心条件修改为转速8 000×g，时间10 min，温度15 ℃。

pH：实验室pH计测定。

固形物含量测定：利用减压干燥法，真空干燥箱、扁形铝制或玻璃制称量瓶、干燥器内附有效干燥剂，天平感量为0.1 mg。

脂肪测定：按GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》进行测定。

蛋白质水解：Foss 8400全自动凯氏定氮仪，准确称取1 g样品，进行凯氏定氮测含氮总量(total nitrogen，TN)。参考MANE等[10]、SAHINGIL等[11]和LIU等[12]的方法并略加修改，分别测定pH 4.6-可溶性氮(soluble nitrogen，SN)、12%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)-SN和5%精对苯二甲酸(pure terephthalic acid，PTA)-SN含量。

质构分析：探头型号TA25/1 000；平端直径50 mm；测试前探头下降速度10.0 mm/s；测试速度1.0 mm/s；测试后探头回程速度1.0 mm/s；时间5.00 s；测试距离15.00 mm；触发力5 g[13]。

黏度测定、流变学特性分析：采用小振幅频率扫描法测定发酵乳的流变特性。选用DHR-3旋转流变仪，直径40 mm的不锈钢平板探头，平板与底面的间隙为1 mm，测试温度控制在25 ℃。

感官评价：根据GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》的要求，参考酸奶感官评分标准，结合牦牛发酵乳特有的感官特性，制定评分标准。

1.4 数据分析

重复试验3次，试验结果以平均值±标准差来表示，用分析软件SPSS 19.0对实验结果进行统计学分析，显著性检验采用 ANOVA 程序中的Duncan法，P<0.05即差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同益生菌株发酵乳特性比较

2.1.1 不同益生菌对牦牛发酵乳酸度及pH值的影响

发酵过程中，不同益生菌对牦牛发酵乳发酵过程酸度有显著影响。如图1-a所示，随着发酵时间延长，益生菌配合普通发酵剂YO-MIX 883(益生菌混合发酵组)使得发酵乳酸度显著提升，变化趋势与普通发酵剂类似，发酵终点(6 h)酸度维持在70 °T左右。然而，3株益生菌单独发酵酸度没有达到理想的食用酸度，仅有20～40 °T，也就是说，在实验设定的发酵时间内，单独益生菌不能成功发酵牦牛乳。与对照组相比，益生菌混合发酵组终点pH值略高，但是显著低于益生菌单独发酵组(图1-b)。无论是单一菌种还是混合菌种，发酵阶段将乳糖转化为乳酸，酸度变化均呈现上升趋势。

在冷藏过程中控制酸度的增加，对发酵乳的感官和品质有着重要的影响，后酸化是活菌发酵乳产品面临的重要问题[14]。在冷藏阶段，益生菌混合发酵组酸度略有上升，而3株益生菌单独发酵上升明显(图1-c)。冷藏4 d后，唾液乳杆菌AR809、植物乳杆菌AR501混合发酵制备的发酵乳酸度(100、 99 °T)显著低于对照组(109 °T)以及植物乳杆菌AR495混合发酵组(107 °T)(P<0.05)。发酵乳制备过程中，随着蛋白质和脂肪的降解，发酵乳体系呈良好的酸碱缓冲状态，因此，酸度变化与pH可能不太一致。冷藏过程中，益生菌混合发酵组制备的牦牛发酵乳pH略高于对照组(图1-d)。从冷藏过程后酸化控制效果来看，AR809和AR501混合发酵效果较好。在冷藏阶段，温度的降低使酸度增长趋于缓和，潘红梅等[15]研究表明，添加了植物乳杆菌的发酵乳在一定程度上酸度的增长变慢，植物乳杆菌和普通发酵菌相互作用，从而控制后酸化。

a-发酵过程中酸度变化;b-发酵终点pH值;c-冷藏期间酸度变化;d-冷藏期间pH值变化图1 不同益生菌对牦牛发酵乳酸度及pH值的影响Fig.1 Effects of different probiotics on lactic acidity and pH of yak fermentation注:同一时间点不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.1.2 不同益生菌对牦牛发酵乳持水力的影响

持水力是酸奶的重要理化指标之一，直接影响酸奶的组织状态[16]。牦牛发酵乳在冷藏前期(1～2 d)，发酵乳持水力呈上升趋势，随后趋于稳定(图2)。对冷藏第4天持水力显著性分析表明，与对照组相比，AR809混合发酵制备的牦牛发酵乳持水力最高，达到74.54%，显著高于其余益生菌发酵组(P<0.05)，表现为发酵乳质地细腻，凝固性好，乳清析出少。人源唾液乳杆菌AR809较高的黏附性，使其在发酵乳中与普通发酵剂的相互作用下可以高效生长，保持了较高的持水力[6]。在相同冷藏条件下，AR809、AR495组的凝胶效果更强，乳蛋白胶体结合水的能力增强，菌体在冷藏期间缓慢生长，其持水力在冷藏后期有缓慢上升的趋势。但是3株益生菌单独发酵的牦牛发酵乳在发酵结束时未完全凝固，倾斜即发生破裂。

图2 不同益生菌对牦牛发酵乳持水力的影响Fig.2 Effects of different probiotics on water holding capacity of yak fermented milk注：显著性是所有的发酵组与对照组对比，***表示P<0.001

2.1.3 不同益生菌对牦牛发酵乳黏度的影响

发酵乳容易出现黏稠度低，颗粒感强，乳清析出等问题[17]。发酵过程中，蛋白凝乳增加了发酵乳的黏稠度。如图3所示，不同益生菌对牦牛发酵乳黏度有显著性影响(P<0.05)。冷藏1 d，益生菌混合发酵组与对照组黏度差异不大，仅AR809混合发酵组有显著性差异。随着冷藏时间的延长，益生菌混合发酵组的黏度显著增加，尤其是AR809与AR495混合发酵组，而对照组黏度变化趋于稳定。冷藏4 d，AR809、AR495混合发酵组黏度分别达到3.11、2.38 Pa·s，为冷藏1 d的1.82、1.47倍。组内比较显示，冷藏4 d后益生菌混合发酵组制备的牦牛发酵乳黏度显著高于对照组，其中AR890混合发酵组黏度最高，为对照组的1.98倍。对于益生菌单独发酵组，由于酸化程度较弱，牦牛乳凝乳失败，因此发酵乳黏度始终处于较低水平。

综上所述，唾液乳杆菌AR809在冷藏过程中能够较好地控制后酸化程度，从而不影响发酵乳口感，并且通过增加持水力和黏度来提高发酵乳的稳定性。因此，后续实验选用AR809作为益生菌发酵剂，配合普通发酵剂制备牦牛益生菌发酵乳，考察发酵乳蛋白降解、流变等特性。

图3 在剪切速率为10 s-1时不同益生菌对牦牛发酵乳黏度的影响Fig.3 Effect of different probiotics on the viscosity of yak fermented milk at a shear rate of 10 s-1

2.2 唾液乳杆菌AR809在牦牛发酵乳中特性的研究

2.2.1 唾液乳杆菌AR809提高牦牛发酵乳蛋白水解程度

实验以牦牛乳为原料，利用唾液乳杆菌AR809以及普通发酵剂制备牦牛酸奶，考察添加AR809对牦牛发酵乳品质的影响。实验结果如表1所示，AR809在发酵及冷藏期间产生胞外多糖等代谢产物，形成品质较好凝乳的同时，牦牛发酵乳固形物含量稍有提升，但是没有显著性，达到23.81%。冷藏结束后AR809混合发酵组与普通发酵剂组的总氮和总脂肪含量没有显著性差异。但是蛋白降解分析表明，与对照组相比，AR809混合发酵组12%TCA-SN和5%PTA-SN指标有显著提高，分别提高了78.22%、40.78%，而pH 4.6-SN无显著变化。pH 4.6-SN代表的是蛋白水解广度[10]，表征的是中肽和小肽的含量，12%TCA-SN代表蛋白质水解深度[11]。磷钨酸溶液是一种辨别力很强的蛋白质沉淀剂，在5%PTA磷钨酸溶液中，所有蛋白质都会沉淀，只有游离氨基酸(赖氨酸和精氨酸除外)和一些短链缩氨酸能溶解在其中。因此通常用5%PTA-SN来表征游离氨基酸含量[12]。结果表明，添加唾液乳杆菌AR809进行牦牛发酵乳制备，能有效加强发酵乳蛋白降解，提高发酵乳中肽及游离氨基酸水平。

表1 不同牦牛发酵乳样品理化指标Table 1 Physical and chemical indexes of different yak fermented milk samples

2.2.2 唾液乳杆菌AR809改善牦牛发酵乳质构特性

对牦牛发酵乳的质构特性进行对比分析，包括第一循环硬度、黏附性、第二循环硬度、内聚性、弹性、胶黏性、咀嚼性、凝胶强度、黏附力等方面，实验结果如表2所示。唾液乳杆菌AR809混合发酵组能够显著改善牦牛发酵乳质构特性。在所测定指标中第一循环硬度、黏附性、第二循环硬度、弹性、胶黏性、咀嚼性有显著提升，其中，咀嚼性、黏附性以及弹性提升最为明显，达到20.42 mJ、21.34 N·mm、14.39 mm，分别为对照组的2.88、2.75、1.68倍。2组酸奶的内聚性、凝胶强度以及黏附力指标没有显著变化。AR809菌株产生的胞外多糖等代谢产物，使得发酵乳具有较好的拉丝性和黏稠性，对质构特性有显著影响，表现为较高的表观黏度和硬度。这与蒋萌蒙等[18]的研究结果是相同的，刘文文等[13]的实验中第一循环硬度、弹性也是显著提高的，与本实验的结论一致。

表2 不同牦牛发酵乳样品质构特性Table 2 Texture characteristics of different yak fermented milk samples

2.2.3 流变学特性分析

采用流变仪分析不同发酵乳样品的流变特性，结果如图4-a所示。添加唾液乳杆菌AR809对牦牛发酵乳剪切流变行为无显著影响，对照组和AR809混合发酵组的表观黏度都随剪切速率的增加而降低，表现出剪切稀化的流体行为，属于假塑性流体。然而，添加AR809能够改变黏度曲线的形状，无论是在低剪切速率还是高剪切速率下，AR809混合发酵组都显示出比对照组样品明显更高的表观黏度。这可能是AR809的加入有利于酪蛋白的凝乳，从而增加发酵乳黏度[19]。

对不同样品的黏弹性进行分析，结果表明，对照组和AR809混合发酵组的储能模量(G′)显著大于损耗模量(G″)[20]，表现出弱的黏弹性凝胶特性，并且G′和G″均对频率有轻微的依赖性(斜率相同)(图4-b)。随着AR809的加入，G′和G″均呈现上升趋势，储能模量的增大，AR809的加入有利于酪蛋白的凝乳结构。损耗角正切(tanδ)考虑到了储能模量和损耗模量的贡献(tanδ=G″/G′)，它可以提供有关材料黏弹性的更多信息。tanδ较低(阻尼系数)是指材料弹性成分的更强贡献，可有助于增加结构的异质性，从而减少与其他基质(例如唾液)的溶混性[21]。tanδ较低的样品比阻尼系数较高的样品更粗大；虽然所有样品的G′曲线显示出相似的频率依赖性(相似的斜率)，但tanδ曲线在样品中仍能表现出差异。包含AR809的发酵乳表现出明显更高的储能模量和较高的tanδ值，这表明其凝胶结构比对照的凝胶结构更多，使得牦牛发酵乳有厚重口感的同时兼有些许顺滑[22](图4-c)。流变学特性分析与前面质构变化研究具有一致性。

2.2.4 感官评价

建立感官评价小组[8],筛选实验室人员培训，由10名品评员组成酸奶感官评价小组。参考TAKUNRAT等[23]并根据牦牛发酵乳特点建立感官描述词(表3)。由感官评价小组对2组发酵乳样品进行感官分析，最终的感官评分如图5所示。结果显示，添加唾液乳杆菌AR809能够显著提高牦牛发酵乳适口性、组织状态、黏附性以及酸甜比，表现为AR809混合发酵组凝固均匀，表面无气泡、龟裂现象，质地评分较高；而对照组发酵组有少量乳清析出，适口性较差。其余指标如颗粒感、奶香味以及糊口感无显著差异。

a-牦牛发酵乳表观黏度曲线；b-储存模量弹性模量扫描曲线；c-损耗角正切扫描曲线图4 牦牛发酵乳流变学特性Fig.4 Rheological properties of yak fermented milk

表3 感官评价评分标准Table 3 Sensory evaluation scoring standard

图5 原味和益生菌牦牛发酵乳感官评价雷达图Fig.5 Radar chart of sensory evaluation of raw and probiotic yak fermented milk

3 结论

前期研究表明，唾液乳杆菌AR809能够有效缓解细菌性咽炎，并且具有良好的胞外多糖合成能力。本文研究表明AR809能够应用于牦牛发酵乳制备，显著改善牦牛发酵乳品质。添加唾液乳杆菌AR809，能够有效控制牦牛发酵乳冷藏过程的后酸化，并且提高发酵乳黏度以及持水力，加强牦牛乳蛋白的水解。质构和流变分析表明，AR809能够提高牦牛发酵乳弹性和咀嚼性，提高发酵乳表观黏度，使得凝乳细腻均匀。感官分析进一步表明，AR809能够提高牦牛发酵乳的适口性和组织状态。本文研究结果表明，添加唾液乳杆菌AR809能够有效改善牦牛发酵乳品质，并且为牦牛发酵乳带来更好的生理活性。