王松海，许 鹏，康 超，陈 捷，杨晨光，谢燕华

陕西省中医医院肿瘤科(西安 710003)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是神经退行性疾病中仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的运动功能障碍性疾病，全球65岁以上人口发病率约2%～3%。PD的神经病理学特征主要是黑质神经元丢失导致黒质纹状体(SNpc)多巴胺缺乏，残存神经元细胞内以a-突触核蛋白为主要成分的路易小体(LBs)大量聚集[1]。在我国北京，大于 65 岁的人群中，男性患病率为1.7%，女性为1.6%，基本与发达国家发病率相同[2]。目前对于帕金森病的发病机制研究虽然越来越多，但是治疗仍以缓解症状支持治疗为主。红景天作为一个有价值的药用植物，我国自古就有将红景天当作补品或治疗疾病的药物来使用的记录。红景天苷(Salidroside，Sal)主要是从红景天的根、块茎中提取出来的，具有较强的抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等活性[3-5]。我们前期体外实验研究表明Sal具有抑制神经元细胞凋亡的作用[6]，同时在体外模型中我们还发现经Sal预处理后自噬通路相关蛋白也有明显激活。因此本研究将继续通过1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)建立PD动物模型，探讨Sal的神经保护作用是否与自噬通路激活相关。

材料和方法

1 实验材料 Sal(Sal，HPLC 法检测纯度> 98%，CAS:82373-94-2),购自四川维克奇生物科技有限公司;胎牛血清、DMEM培养基、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG的抗体(二抗)购自碧云天公司。TH抗体、MPTP(购于Sigma)、罗丹明123(CAS:62669-70-9)购自Sigma公司;兔抗大鼠PINK1、Parkin、LC-3、Beclin1抗体(一抗)购自abcam(ab216144、ab15494、ab48394、ab207612)公司，Beta-actin抗体(一抗)购自abcam(ab8227)公司，Alexa594 标记的驴抗鸡抗体(二抗)购自北京中杉(ZB-20301)公司。

2 实验方法

2.1 实验动物:雄性C57BL/6小鼠，体重22～25 g，8周龄，由第四军医大学实验动物管理中心供应，动物房间的温度被控制在(23±1)℃，按时换料换水，每隔12 h开关1次灯光，周期固定，实验前将各组小鼠进行适应性养殖7 d。

2.2 动物分组：根据实验设计，共分为三组(每组8～12只)。对照组(腹腔注射0.9%氯化钠，14 d)，MPTP处理组(MPTP 30 mg/kg 7 d+等量盐溶液7 d)，Sal治疗组(Sal 50 mg/kg，1 h后+MPTP 30 mg/kg 7 d，第8天至第14天，用Sal 50 mg/kg处理)，每组7～10小鼠。

2.3 Sal对PD小鼠行为学的影响:爬杆试验方法：选取直径8 mm，长约50 cm表面粗糙铁杆，用双层纱布包裹，防止打滑。小鼠在测试前两天可进行适应性训练。试验开始后，每组小鼠在药物处理结束1 d后进行测试。将小鼠头朝上放于杆的顶部，记载小鼠头完全变成向下的时间(Tturn)，和小鼠完全爬下来到地板上(TLA)的时间。

2.4 免疫组化法:将切片置于在PBS 0.01 mol/L溶液中漂洗3次，10 min/次。放入一抗(鸡抗TH抗体1∶400，1% 胎牛血清蛋白，0.3% Triton X-100)中室温孵育24 h。后再次将切片放入PBS 0.01% 溶液中漂洗3次，10 min/次。后将切片放入二抗(Alexa594 标记的驴抗鸡 1∶500) 中室温避光孵育 2 h。处理结束后，同前，继续漂洗，贴片，封片，避光保存。最后在荧光显微镜下观察TH阳性神经元细胞存活情况。

2.5 Western blotting检测:根据实验设计，每组处理的中脑黑质分别加入100 μl裂解缓冲液。将裂解液放在冰上孵育30 min，然后以12000 g在4 ℃离心机中离心分离，离心5 min，收集上清液，各组提取液中蛋白质浓度用BCA方法测定。用SDS-PAGE凝胶电泳。后进行 Western Blot 检测，ECL发光液发光检测，Bio-Rad凝胶图像仪扫描分析结果。每组实验重复3次。求取平均值，从而算出每组SNpc中LC-3β、Beclin 1、PINK1、Parkin含量。

结 果

1 Sal对PD小鼠行为学的影响 小鼠在MPTP预处理后出现了典型的 PD 症状。PD小鼠行为学检测结果显示:与对照组比较，模型组小鼠Tturn及TLA明显延长(P<0.01);而给予 Sal(50 mg /kg) 治疗后，与MPTP组比较，小鼠的Tturn转头时间和TLA爬杆时间显著缩短(P<0.05)。见图1。

注：与对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05图1 Sal对PD小鼠行为学的影响[A：Sal化学结构；B：小鼠头完全变成向下的时间(Tturn)； C：小鼠完全爬下来到地板上的时间(TLA) ]

2 Sal对SNpc内 TH细胞水平的影响 通过免疫组化的方法对PD小鼠模型SNpc中TH阳性神经元细胞进行检测。与正常组比较，PD模型组小鼠 TH阳性神经元数目下降明显，而经过Sal提前干预治疗后的TH阳性神经元数目明显恢复。与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

A：TH阳性细胞在对照组;B:MPTP组;C:Sal+MPTP组;D:TH阳性细胞在各组中的统计，与空白对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05图2 Sal对黑质内 TH阳性细胞水平的影响

3 Sal对PD小鼠黑质纹状体内LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin相关蛋白表达的影响 与对照组相比，MPTP处理后黑质纹状体内LC-3β、Beclin1表达增多，PINK1、Parkin表达减少(P<0.01)，而Sal预处理可以明显改善这些变化，如Sal预处理后，黑质纹状体内LC-3β、Beclin1蛋白表达水平明显下降，而PINK1、Parkin蛋白表达水平明显上升(P<0.05)。见图3。

注：与空白对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.05图3 Sal和MPTP对于SNpc内LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin的影响(A：LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin蛋白Western-blot结果;B：LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin蛋白统计分析结果)

讨 论

目前认为PD发病机制的学说主要有运动神经元异常凋亡学说、线粒体功能障碍学说、氧化应激学说等，尽管他们有着不同的流行病特点，但仍然有一些共同的生化病理特征，比如残存神经元细胞内以a-突触核蛋白的大量聚集[5-7]。我们以前的研究结果证明红景天苷具有抑制细胞内氧化应激,进一步的研究还表明Sal可以激活细胞内异常蛋白聚集清除系统-泛素蛋白酶系统[8]，但是对于损伤或凋亡细胞内器官的自动降解途径-自噬系统，是否在帕金森病的发病过程中起到作用，仍需我们进一步的研究。

目前人们研究表明细胞内蛋白质形成与降解的动态平衡对于细胞的存活非常关键，泛素蛋白酶系统(UPS)和自噬-溶酶体途径(ALP)是修复或者清除异常蛋白的重要途径[9-11]。有实验研究结果表明，早期在帕金森病发病过程，氧化应激等因素导致线粒体膜受损，引起膜电位去极化，使得细胞膜上PINK1蛋白被激活，激活后的PINK1蛋白转位到线粒体外膜，诱导下游Parkin在线粒体外膜聚集[12-13]。Parkin在线粒体外膜的聚集可以加强线粒体的分裂，从而有利于受损伤的线粒体被清除。同时Parkin移位到线粒体后E3泛素连接酶的活性增加，使得多种线粒体底物泛素化，从而使得受损的线粒体被清除掉。同时Parkin介导的线粒体泛素化后，泛素结合接头蛋白P62既可与线粒体底物结合，又可与LC3、Beclin1结合介导泛素化线粒体进入自噬体，然后通过自噬体与溶酶体融合以清除受损线粒体[14-15]。

因此本研究采用MPTP-C57BL/6小鼠模拟PD体内模型，经Sal预处理后，其行为协调能力得到一定程度的改善，受损的TH 阳性神经元明显减少。进一步我们发现SNpc内自噬相关蛋白LC-3β、Beclin1表达增多，PINK1、Parkin表达减少，经Sal预处理后上述损伤可明显改善。综上所述，Sal对于PD模型中DA能神经元的保护机制可能与激活线粒体相关自噬通路有关，与我们之前PD体外研究的结果一致。