陆盈，孙顺昌

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院 检验科，上海 200025；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院北院 检验科，上海 201801）

脊髓小脑型共济失调（spinocerebellar ataxia, SCA）是一组临床和遗传均具异质性的遗传性神经系统退行性疾病，主要临床表现为小脑性共济失调，可伴有构音障碍、意向性震颤、眼球运动障碍等症状[1]。SCA 遗传模式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X-连锁隐性遗传等模式，以常染色体显性遗传为主[2]。目前临床已发现30 多型SCA，其中大部分型SCA 的致病基因已被确定[3]。研究发现，SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12、SCA17 和齿状核红核苍白球路易体萎缩症（dentatorubral-pallidoluysian atrophy,DRPLA）等亚型是由基因编码区CAG 三核苷酸重复序列的拷贝数增加所致，而CAG 编码的氨基酸为谷氨酰胺，因此该亚型SCA 又称为多聚谷氨酰胺病，即PolyQ 病[4]。SCA1 致病机制仍不完全清楚，有研究显示SCA1 发病与突变产物的堆积有关，也有研究显示SCA1 发病与正常失调蛋白（Ataxin-1）的功能缺失有关，Ataxin-1 是ATXN1基因的表达产物[5]。本研究通过构建正常和突变的ATXN1基因，采用实时荧光定量PCR 检测正常和突变ATXN1 mRNA 的水平，分析ATXN1基因内PolyQ 重复数的增加对基因自身转录的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

SW-CJ-1D 型超净工作台和BHC-1300IIA/B3 型生物安全柜（苏州江苏苏静集团），3111 型二氧化碳培养箱和ST16R 型低温冷冻离心机（美国赛默飞公司），MF51 型倒置显微镜（广州明美光电公司），ABI7500 荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）扩增仪（美国Life technology 公司），SMA4000 型超微量分光光度计（北京Merinton 公司），Bestar 逆转录试剂盒和qRT-PCR 扩增试剂盒（德国DBI 公司），引物由Life technology 公司合成，人胚肾细胞（293T 细胞）和大肠杆菌Stbl3（广州辉骏生物科技有限公司），DMEM 细胞培养液、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶（美国Gibco 公司），BC117125.1 克隆质粒和pLVX-Puro-3xflag-C、pMD2.G 及psPAX2 载体（广州辉骏生物科技有限公司），ATXN1-MUT 基因由广州辉骏生物科技有限公司合成。

1.2 pLVX-Puro-3xflag-ATXN1 表达载体构建及鉴定

以BC117125.1 克隆质粒为模板扩增正常ATXN1基因（ATXN1-WT），突变ATXN1基因（ATXN1-MUT）通过化学合成。ATXN1-WT 和ATXN1-MUT 用核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，再用T4 DNA连接酶接到pLVX-Puro-3xflag-C 载体上构建pLVXPuro-3xflag-ATXN1-WT（野生）和pLVX-Puro-3xflag-ATXN1-MUT（突变）表达载体。同时以pLVX-Puro-3xflag-C 空载体为载体对照。将构建的野生型和突变型表达载体，以及载体对照分别导入感受态大肠杆菌Stbl3 中进行克隆，收集菌液并抽提质粒。通过核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切及测序鉴定构建的野生型和突变型ATXN1表达载体。

1.3 ATXN1 稳转细胞株的筛选及鉴定

将包装质粒和上述经鉴定构建正确的pLVX-Puro-3xflag-ATXN1-WT 或pLVX-Puro-3xflag-ATXN1-MUT表达载体质粒及载体对照分别共转染293T 细胞，产生重组慢病毒颗粒，并用超速离心法进行纯化。在Polybrene 介导下，用重组慢病毒颗粒感染293T 细胞，用Puromycin 筛选稳定表达野生和突变Ataxin-1 蛋白的细胞株，通过Western blotting 鉴定表达的野生和突变Ataxin-1 蛋白。将稳定表达野生和突变Ataxin-1 蛋白的细胞株和携带载体对照的293T 细胞继续培养，通过实时荧光定量PCR 检测ATXN1 mRNA 的表达水平。

1.4 ATXN1 转录检测方法的建立

依据Trizol RNA 分离试剂盒说明书抽提细胞内总RNA，并溶解于无RNA 酶的灭菌水中，紫外分光光度计检测RNA 浓度和纯度。将RNA 溶液加入到gDNA吸附柱，室温13 200 r/min 离心1 min，过柱，收集的滤液即为去除基因组DNA 的RNA 溶液。依据Bestar逆转录试剂盒说明书合成cDNA 备用。依据ATXN1序列（NM_001128164）和GAPDH序列（NM_002046.3），使用Primer 3 在线软件（http://primer3.ut.ee/），分别设计扩增ATXN1 和GAPDH cDNA 的引物（见表1），分别扩增目的基因ATXN1和内参基因GAPDH，表达野生和突变Ataxin-1 的细胞株分设3 份，293T 细胞和携带载体对照的293T 细胞也分设3 份，4 组同时进行扩增，依据试剂盒说明书推荐的扩增体系配置扩增反应液。扩增程序为95℃预变性2 min，共45 个循环，每一循环包括95℃变性10 s，60℃退火34 s（采集荧光信号），72℃延伸30 s，循环结束后从60℃升温到98℃获取熔解曲线。以GAPDH 扩增Ct 值（荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）为参考，计算ATXN1基因表达的相对量（-△Ct）=ATXN1基因Ct 值均值-GAPDH基因Ct 值均值。野生型和突变型ATXN1表达量差异（-△△Ct）=-△Ct 野生型-（-△Ct突变型）。

表1 PCR 扩增所用引物

1.5 ATXN1 转录检测方法的评价

通过慢病毒载体介导，本研究将野生ATXN1和突变ATXN1表达载体导入293T 细胞，通过qRT-PCR检测正常ATXN1 和突变ATXN1 的mRNA 水平。通过扩增曲线判断ATXN1和GAPDH基因是否成功扩增，通过扩增后熔解曲线分析判断ATXN1和GAPDH基因扩增是否为特异扩增。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。细胞内野生型和突变型ATXN1相对表达量以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATXN1 转录水平检测方法建立成功

ATXN1和GAPDH基因的扩增曲线呈S 形，显示扩增方法成功（见图1），扩增后熔解曲线分析显示ATXN1和GAPDH基因的熔解曲线峰值分别在X 轴同一位点，说明扩增产物分别为均一性产物，即扩增为特异性扩增（见图2）。因此本研究的扩增方法可用于对ATXN1 mRNA 进行相对定量。

图1 GAPDH 和ATXN1 基因扩增曲线

图2 GAPDH 和ATXN1 基因的熔解曲线

2.2 ATXN1 基因内PolyQ 重复变异对基因自身转录的影响

通过实时荧光定量PCR 扩增发现293T 细胞内正常ATXN1 mRNA 的相对表达量为（661.9±17.7），而突变ATXN1 mRNA 的相对表达量为（381.0±20.5），两者比较，差异有统计学意义（t=17.950，P=0.006），正常ATXN1 mRNA 的相对表达量高于突变ATXN1 mRNA，正常293T 细胞和仅转染载体对照的293T 细胞中ATXN1 mRNA 的相对表达量分别为（1.0±0.1）和（0.3±0.0）。

3 讨论

ATXN1基因定位于6p23，基因全长约450 kb，含9 个外显子，表达产物为Ataxin-1 蛋白。在ATXN1基因外显子7 中存在一段CAG 三核苷酸重复序列，正常人群中重复数为6 ～44，且多被1 ～4 个编码组氨酸的CAT 序列隔开[6]。SCA1 是ATXN1基因外显子7 中的CAG 重复序列拷贝数增加所致的退行性疾病，CAG重复序列数越多，患者的发病年龄越早，疾病越严重。CAG 重复序列数增加致SCA1 的机制目前尚不完全清楚[7]。有研究发现，小鼠被敲除ATXN1基因后并未出现共济失调症状或浦肯野细胞的病理改变；另有研究发现在小鼠和果蝇体内过度表达PolyQ 超出正常长度的Ataxin-1 会导致神经退行性改变，甚至在小鼠和果蝇体内过度表达正常的Ataxin-1 蛋白也会导致神经元的退行性改变，只是病变程度较突变Ataxin-1 蛋白所致轻[8]。因此，SCA1 发病的分子机制与突变产物毒性功能获得有关。在ATXN1基因杂合突变小鼠体内，若再敲除另一拷贝的正常ATXN1基因，小鼠的SCA1症状会进一步加重，这显示正常Ataxin-1 蛋白功能的丢失也可能与SCA1 发病有关[9]。现有研究结果显示，SCA1 发病机制较为复杂，既有突变蛋白的毒性功能获得，也有野生蛋白的功能缺失[10]。此外，SCA1 的发病可能还与Ataxin-1 蛋白的修饰有关，Ataxin-1 蛋白翻译后需经修饰才具有生物功能，这些修饰有磷酸化、泛素化、类泛素化、转谷氨酰胺等，这些修饰能改变Ataxin-1 蛋白的稳定性或Ataxin-1 蛋白对靶基因的调控能力，导致SCA1 病，如Ataxin-1 蛋白776 位丝氨酸残基通过Akt 激酶被磷酸化，可与14-3-3 蛋白作用形成包涵体，使神经元发生退行性改变，Ataxin-1分子中PolyQ 长度越长，Ataxin-1 与14-3-3 蛋白作用愈强[11]。

一般认为Ataxin-1 蛋白为转录抑制因子，参与其转录调控的分子有Capicua、HDAC3、Gfi-1 等[12]。ATXN1基因外显子7 中的CAG 重复序列拷贝数增加会影响其调控的目标基因转录，但对ATXN1基因自身转录是否产生影响，目前未见报道。本研究发现，突变ATXN1基因转录产物mRNA 在细胞内的相对表达量低于正常ATXN1基因。以往研究显示，Ataxin-1蛋白有3 段氨基酸残基结构与SCA1 发病密切相关，它们分别是PolyQ 结构段、AXH 结构段及近C 端的NLS 结构段[13]。PolyQ 延伸是SCA1 发病的基础，AXH 肽段结构中570 ～689 位氨基酸对Ataxin-1 蛋白聚集作用是SCA1 发病的因素之一，NLS 结构段引导Ataxin-1 蛋白进入胞核也是SCA1 发病的一个因素[14]。本研究显示，PolyQ 延伸同时导致ATXN1基因转录量减少，推测ATXN1基因内PolyQ 重复变异抑制ATXN1基因自身转录可能对SCA1 发病产生影响，突变的Ataxin-1 量减少，则进入胞核的突变Ataxin-1减少，理论上可减轻SCA1 发病。因此，本研究认为PolyQ 延伸可通过影响基因转录，减轻SCA1 发病。