刘霞，张乔，张慧杰

（中国医科大学附属盛京医院 妇产科，辽宁 沈阳110004）

子宫颈癌是全球范围内第4 位常见的恶性肿瘤[1]，持续性高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papilloma virus, HR-HPV）感染是导致子宫颈鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）及其癌前病变发生的必要但不充分病因[1-2]。目前SCC 发生的模式按照以下步骤进行： 急性HR-HPV 感染，持续性HRHPV 感染导致不同程度的子宫颈上皮细胞异常，包括子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）Ⅰ～Ⅲ级；或2 级分类系统的宫颈低级别和高级别鳞状上皮内病变（low-grade/high-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL/HSIL），最终进展为浸润性SCC[3]。子宫颈癌发生的机制尚不完全清楚，一些病毒和宿主的基因事件可能促进正常宫颈上皮向恶性肿瘤的转变[2，4-5]。HPV 基因组在宫颈组织中以3 种形式存在（环状游离型，整合到宿主基因组中，或者两者共存的混合型）[4-6]。整合发生在HPV 病毒致癌基因E6、E7的下游，通常在E2或E1基因区域[1]；HPV DNA 整合到宿主细胞基因组后，癌基因E6、E7和长控制区域（long control region, LCR）通常被保留,而E2基因优先被删除或破坏[4]。因此，E2、E6基因的比值（E2/E6）被提出可作为评估HPV 基因组整合的替代标志物[7-8]。HR-HPV 基因组整合后由于E2 蛋白负调控功能的丧失，通常导致E6、E7癌基因的表达失调，因此病毒整合可能参与HPV-相关肿瘤的致癌过程。

HPV-16 是SCC 及其癌前病变（CIN Ⅱ/Ⅲ或HSIL）中最常见的高危因素[4，9]。已有的关于HPV-16整合在宫颈病变中的作用尚存在争议。一些研究表明，HPV 整合与宫颈病变的严重程度相关[1，4，10]，而另一些研究则相反[11-12]。此外，一些学者认为HPV整合是发生病毒感染过程的早期事件，即发生在LSIL或正常宫颈上皮细胞中[11，13]，而另一些学者认为病毒整合是与从HSIL 进展到SCC 相关的晚期事件[14]。HPV 基因组的整合率随病毒感染的型别、部位、疾病的严重程度或其他的生物-地理因素而变化[4，7]。该研究采用多重聚合酶链反应（PCR）技术[8，11]对来自中国东北地区428 例HPV-16 阳性的不同级别宫颈病变及正常宫颈上皮女性的宫颈脱落细胞中HPV-16 DNA 的整合状况进行全面分析，探讨其与子宫颈病变严重程度的相关性及其在宫颈癌变中发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年8月—2017年12月于中国医科大学附属盛京医院妇科进行宫颈癌筛查HPV-16 的妇女428 例。研究经本院医学伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。

研究对象分为病例组354 例，包括经组织病理学证实SCC 组103 例，HSIL 组（CIN Ⅱ/Ⅲ）251 例。对照组74 例，包括经组织病理学证实的34 例LSIL组（CIN Ⅰ）和40 例正常宫颈上皮组（因良性妇科肿瘤行子宫切除术并经病理证实排除宫颈病变的女性）。在收集宫颈脱落细胞时患者年龄18 ～67 岁，平均（38.9±8.8）岁。对患者进行如下检测： 常规妇科检查，Thin Prep ®细胞学检测（TCT）及HPV 分型检测。宫颈脱落细胞标本采用锥形宫颈刷取样，宫颈细胞学标本取样步骤和要求按照常规进行。用窥器轻轻暴露宫颈后，先用棉拭子拭净宫颈表面分泌物，将宫颈刷置于子宫颈管内达子宫颈上方1.0 cm 左右的宫颈鳞柱交界处取样，宫颈刷在子宫颈管内旋转3 ～5圈后取出，将刷取的宫颈脱落细胞洗脱于1 个包含20 ml Preserv Cyt 溶液的小瓶中，细胞标本放置在保存液中2 周内检测，4℃冰箱保存。经Thin Prep ® 2000系统程序化处理宫颈脱落细胞标本，制成直径2 cm的薄层细胞涂片，采用巴氏染色[15]。所有标本在宫颈活检或治疗前采样。采用2001年TBS 系统进行细胞学检测结果分类： 上皮内病变恶性肿瘤阴性（negative for intraepithelial lesion malignancy, NILM），意义未明非典型鳞状细胞（atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US），非典型鳞状细胞伴不能排除高级别鳞状上皮内病变（atypical squamous cells with high-grade lesion that cannot be excluded, ASC-H） 或LSIL 及HSIL。剩余标本置入-20℃冰箱冷冻保存，2个月提取DNA 用于HPV 分型检测。患者具有免疫缺陷疾病史、妊娠、盆腔化疗或放疗病史，或宫颈治疗或活检病史不包括在该研究中。

1.2 材料与试剂

Thin Prep ® 2000 细胞学检测系统（TCT）（美国Cytyc 公司），QIAamp DNA 提取试剂盒（德国Qiagen Hilden 公司），SiHa 宫颈癌细胞株购自美国培养中心（美国ATCC 公司），HeLa 细胞株（由该院感染科实验室惠赠），10%胎牛血清（德国Gibco Chrome 公司），100 bp DNA 梯度（美国 Invitrogen 公司），TaqMan 多重PCR 试剂盒（北京TIANGEN 生物技术有限公司)。

1.3 仪器与设备

HPV 分型检测采用凯普HPV Geno Array 技术（香港Hybri Bio 有限公司），PCR 循环仪（德国Eppendorf Master-cycler Gradient 公司），台式高速离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂），LDZ5-2 低速离心机（北京时代北利离心机有限公司），紫外分光光度仪（美国Beckman Coulter 公司）；电泳图像扫描仪（Tanon 4100）（上海天能公司），Primer Premier 5.0 软件（加拿大Premier 公司），Stata 11.1 软件（美国Stata 公司），电泳图像分析软件（美国Bio Image Ann Arbor Mich公司）。

1.4 实验过程

1.4.1 细胞株培养及细胞DNA 提取SiHa 宫颈癌细胞株含有1、2 个整合的HPV-16 用于多重PCR的阳性对照。HeLa 细胞株含有1 个整合的HPV-18 DNA 作为阴性对照。SiHa 和HeLa 细胞在改良的DMEM 和RPMI 1640 培养基中培养，分别补充10%胎牛血清，在37℃、饱和湿度、5%二氧化碳CO2标准条件下培养。

从宫颈脱落细胞及细胞株中提取总的细胞DNA，采用DNA 试剂盒进行，从细胞保存液中提取3 ml经离心后用于DNA 制备；采用紫外分光光度计在OD260/280 处测定DNA 浓度。通过扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因确定存在人基因组DNA。只有GAPDH扩增阳性的标本进一步行HPV 分型检测[15]。

1.4.2 HPV 分型检测、阴道镜和组织学诊断HPV基因分型检测采用核酸分子快速导流杂交基因芯片技术，该技术能同时检测21 种HPV 基因型，包括6 种低危型HPV（low-risk HPV, LR-HPV）类型（6，11，42，43，44 型和CP8304 相当于81 型），14 种HR-HPV类 型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和68 型）和1种可能HR-HPV 型53。基本原理是先将HPV DNA 进行基因扩增，然后利用其特有专利的导流杂交技术使目的分子导流穿过固定有DNA 探针的基因芯片薄膜进行快速杂交。具体步骤包括： 样本HPV DNA 分离、提取；PCR 扩增；核酸分子快速导流杂交、显色；最终的结果分析通过芯片的颜色变化直接进行肉眼判读[15]。

HPV-16 阳性的患者，无论其宫颈细胞学结果如何，均转诊阴道镜。阴道镜检查后在任何可疑宫颈病变区域进行点活检。对不满意阴道镜检查，进一步行子宫颈管内膜搔刮术（endocervical curettage,ECC）。组织学诊断在宫颈脱落细胞取样后3 个月内获得。宫颈组织标本是通过宫颈活检，环状电切（loop electrosurgical excision procedures, LEEP）锥型切除或全子宫切除获得。对具有多个组织学诊断的患者，以最严重的诊断为最终结果。所有组织学切片均由该院2 位病理医师盲法审阅。如果前2 位病理医师的诊断不一致，由第3 位病理医生盲法审阅病理切片。多数病理医生的判定结果作为最终的诊断。

1.4.3 多重PCR 检测HPV-16 基因组的体内状态HPV-16 基因组的体内状态用多重PCR 法进行盲法分析。如果E2/E6的比值是0，则HPV DNA 认为是“纯整合”型；如果比值≥1 是纯游离型，如果比值为0 ～＜1 是混合型[4，16]。

针对HPV-16E2和E6基因的多重PCR 是在一个反应试管内同时扩增E2和E6基因，扩增在25 μl终反应混合物中进行： 包含2.5 μl 的样本DNA，每个引物0.25 μmol，10×PCR 缓冲液2.25 μl，2 μl dNTPs，0.20 μl TaqMan（5 u/μl）和17.05 μl ddH2O。循环条件是94℃预变性5 min，随后30 个周期为94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，最终72℃继续延伸5 min。

HPV-16E2和E6的引物用Primer Premier 5.0 设计，用于扩增HPV-16E2和E6基因的引物见表1。扩增后，5 μl 多重PCR 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，用100 bp DNA 梯度标记,然后在紫外线（UV）下显影。测量并分析E2和E6基因扩增条带的面积和灰度，然后计算E2/E6基因的比值。每个样本检测一式3 份。

1.5 统计学方法

数据分析采用Stata 11.1 统计软件。计数资料采用例（%）表示，比较采用χ2检验；不同级别宫颈病变中HPV DNA 整合率的变化采用χ2趋势分析；HPV-16 DNA 整合与现患≥HSIL 病变风险采用多因素非条件Logistic 回归分析；SCC 相关因素采用Logistic 回归分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 多重PCR 的引物

2 结果

2.1 两组SCC 相关因素的比较

患者平均年龄： 病例组（37.1±4.0）岁，对照组（36.9±3.9）岁。两组年龄、使用激素避孕药、终生男性伴数、同时感染其他高危型比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。两组吸烟状况比较，差异有统计学意义（P＜0.05），病例组多于对照组。见表2。

2.2 不同级别宫颈上皮细胞HPV-16 DNA 的整合状况

病毒的整合率随宫颈病变的严重程度的加重而升高（χ2=78.096，P=0.000）。HPV-16 DNA 的整合率（即混合型例数+纯粹整合型例数/总病例数）从对照组的6.8%（5/74）上升到HSIL 组中的29.9%（75/251）及SCC 组中的68.0%（70/103）[HSIL 组与SCC 组比较（χ2=43.796，P=0.000），病例组与对照组比较（χ2=31.455，P=0.000），LSIL 组与HSIL 组比较（χ2=6.679，P=0.008）]。在SCC 组 中，HSIL 及LSIL 整合型HPV-16 DNA 均以混合型为主。整合型的HPV-16 DNA 在SCC 女性中最常见，并且在32.0%（33/103）的SCC 患者中检测到纯粹游离型。该研究检测到的纯粹游离型及混合型HPV-16 DNA 的E2/E6基因比值范围分别为1.00 ～2.34 和0.42 ～0.98。见图1和表3。

表2 两组SCC 相关因素的比较 例（%）

2.3 HPV-16 DNA 整合与宫颈病变严重程度的相关性

SCC 组、HSIL 组及对照组HPV-16 基因组整合率的变化趋势比较，差异有统计学意义（Z=8.530，P=0.000）。

图1 HPV-16 E2、E6 基因电泳结果

表3 不同宫颈病变程度HPV-16 DNA 体内状态

HPV-16 DNA 整合与现患HSIL 或SCC 风险的相关性采用非条件Logistic 回归分析，因变量（Y）是组织病理学结果；将吸烟状态和同时感染其他HR-HPV型别纳入多变量分析模型（α=0.10）。Logistic 回归分析显示调整吸烟状态及合并感染其他类型HR-HPV因素后，HPV-16 DNA 整合与现患HSIL 或SCC 风险的=2.30（95% CI： 1.62，3.18）。

3 讨论

该研究结果显示，HPV-16 DNA 整合率随宫颈病变的加重而升高，这一结果与已有的一些研究报道相一致[7，16]。本研究在组织病理学证实的不同级别宫颈上皮细胞中进一步分析HPV-16 DNA 的整合状况，非条件Logistic 回归结果显示HPV-16 基因组整合与现患HSIL 或SCC 的风险相关，进一步支持病毒整合促进HPV-相关肿瘤癌变的结论[4，6]。HPV 基因组整合很可能是通过促进HPV 持续性感染，以及病毒整合后E2 负反馈调节蛋白功能的丧失，引起E6、E7癌基因表达失调，从而促进子宫颈上皮癌变的发生。另外，该研究结果显示相当一部分（32.0%）SCC 女性仅含有纯粹游离型的HPV-16 基因组，这与文献报道的比例（24.7%～34.0%）相似[2，17]。目前关于宫颈癌发生的潜在机制尚未完全阐明，有研究结果进一步支持HPV 基因组整合并非是宫颈癌发生的必要因素这一观点[17]。一些研究显示在具有纯粹游离型HPV DNA的肿瘤中，整合部位的基因或表观遗传调控可能导致E6、E7致癌基因表达失调[6，18]。表明尽管在宫颈癌中通常能检测到病毒整合，但病毒整合在宫颈癌变过程中并非是先决条件。因此，进一步研究与HPV 整合相关的宫颈癌发生的具体作用机制，如免疫逃逸相关的机制及整合部位的基因或表观遗传调控等机制将为深入阐明HPV-相关肿瘤的发病机制提供更为有价值的信息。

另外，该研究显示在组织学证实的LSIL 及正常宫颈上皮细胞中均能检测到整合型HPV-16 基因组，该结果进一步证明病毒整合发生在HPV-16 感染自然史早期这一假设[8，13，16]。已报道的在LSIL 或正常宫颈上皮细胞中HPV-16 DNA 的整合率范围波动较大，从8.0%（5/62）[19]→28.2%（3/11）[20]→43.8%（7/16）→60.0%（3/5）[1，8]。该差异可能部分归因于不同的生物-地理因素，如地理区域和研究人群或不同的检测方法。

该研究的某些局限性如下。首先，采用多重PCR技术同时扩增病毒E2、E6基因用E2/E6基因比值评估HPV-16 DNA 的整合状态，已有研究表明该方法能更为准确地确定HPV DNA 的体内状态，与单一PCR法相比能获得更为可靠的E2/E6比值[7-8]。但鉴于宫颈脱落上皮细胞标本可能是异常和正常上皮细胞的混合物，该方法不能区分哪种类型的宫颈上皮细胞含有整合型或纯粹游离型病毒DNA，或者两者共存于同一个宫颈细胞内。因此，在未来的研究中采用单细胞水平分析HPV 感染状态（即利用激光显微切割分离出单个感染HPV 的细胞，然后进行HPV DNA 分析），可能会为病毒整合在HPV-相关肿瘤发生机制中的作用研究提供更为有趣的线索。其次，HPV 基因组整合事件及其随后的克隆选择（即整合体具有转录活性）可能是2 个独立的过程，该研究仅分析病毒基因组的整合率，进一步研究整合后的转录情况将有助于更好地理解病毒整合在宫颈病变进展中的致癌机制。尽管如此，该研究的结果进一步支持病毒整合促进HPV-相关肿瘤癌变过程的结论。第三，该研究中采用E2/E6比值作为HPV DNA 整合的替代标志物，鉴于E2基因是HPV DNA 整合的优先区域；但HPV DNA 整合还可能涉及E1基因的删除或断裂[1]。因此，进一步检测E1 开放阅读框将为病毒整合在HPV-相关肿瘤发生中的作用提供更为精准的信息；并且为进一步阐明与病毒整合相关的具体宫颈癌发病机制提供更有价值的相关信息。

综上所述，HPV-16 DNA 的整合率随宫颈病变的加重而升高，HPV-16 DNA 整合与现患HSIL 及以上病变的风险存在相关性，表明HPV-16 基因组整合发生在病毒感染自然史的早期，病毒整合在子宫颈癌变过程中发挥促进作用。