孔晓玲，张晓梅，洪伟伟，张琰，沈波，程艳萍，杨圣，梁戈玉

（1.东南大学 公共卫生学院，江苏 南京 210009；2.江苏省肿瘤医院，江苏 南京 210009）

结肠直肠癌是世界上常见的癌症类型之一[1]。近10年来，中国结直肠癌的发病率迅速上升[2]，据统计，2014年中国结肠直肠癌新发病例约37.0 万，死亡病例约18.0 万，分别居恶性肿瘤第3 和第5 位[3]。结直肠癌的发病和进展与个体遗传差异密切相关，因此寻找与结直肠癌进展相关的分子生物学标志物能为判断或预测肿瘤进展提供分子水平依据。代谢酶是生物体内物质代谢的重要组成部分，参与各种生命活动和过程。已有研究报道，代谢酶基因多态性可能影响基因、蛋白表达以及酶活性，影响物质代谢过程，从而改变生物体的暴露，最终影响结直肠癌的发病、治疗和预后。谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）代表1个Ⅱ相解毒酶超家族，参与内源外源活性物质的代谢。其作用机制为GST 酶催化谷胱甘肽与亲电物质结合，使其转变为亲水性代谢物，从而消除有害物质。研究发现GST 酶可促进各种致癌物质、治疗药物、环境毒素和氧化应激产物的解毒。谷胱甘肽S-转移酶M3（GSTM3）rs7483 位于编码区，该单核苷酸多态性（single nueleotide polymorphism,SNP）能影响GSTM3 酶活性[4]，但目前尚无GSTM3 rs7483 与结直肠癌进展的相关报道。二氢嘧啶脱氢酶（dihydropyrimidine dehydrogenase, DPD）由二氢嘧啶脱氢酶基因（dihydropyrimidine dehydrogenase gene, DPYD）编码，是调节胸腺嘧啶或尿嘧啶等的第1 阶段代谢酶，其代谢受阻可导致严重的毒性效应，如RNA 或DNA损伤[5]。rs1801159 是位于DPYD 编码区的SNP，能导致密码子543 处的异亮氨酸翻译成缬氨酸。研究报道称rs1801159 能降低DPD 活性，可能与结直肠癌的进展有关[6]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（uridine diphosphate glucuronyltransferase, UGT）广泛表达于肝脏、胃和肠道等组织。研究表明，当UGT基因发生变异，酶活性可能降低或丧失，导致内外源性化合物与结肠黏膜组织葡萄糖醛酸的结合能力降低，解毒减少，致癌物的暴露增加，可能影响胃癌、结直肠癌、肝癌等癌症的发病、进展和预后[7-8]。

本研究通过NCBI dbSNP 数据库，选择与结直肠癌发生、发展可能相关的代谢酶基因，并在中国汉族人群中选择次要等位基因频率（minor allele frequency,MAF）＞20%的3 个候选SNPs，分别是GSTM3 rs7483、DPYD rs1801159 和UDP 葡糖醛酸基转移酶1 家族多 肽A1（UDP-glucuronosyltransferase 1A1, UGT1A1）rs3755319，研究候选SNPs 与结直肠癌临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2016年1月—2017年7月江苏省肿瘤医院结直肠癌患者外周血690 份。其中，男性427 例，女性263 例；平均年龄（57.83±11.64）岁；平均BMI（23.03±2.91）kg/m2。由于48 例缺少分化程度资料，只分析了642 例患者的基因多态性与分化程度的关系。纳入标准： ①研究对象同意参加本研究；②经组织病理学确诊为结直肠癌患者；③年龄、性别不限。排除标准： ①同时患其他肿瘤或有肿瘤史者；②经诊断患严重的消化道疾病或严重心脑血管疾病等疾病者。每人抽取2 ml 外周静脉血于抗凝管，然后置于-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取试剂盒（德国QIAGEN 公司），2×Hot Taq @ PCR Reaction Mix（美国Stegene Bio Technoloaies 公司），探针和引物由南京骥骜生物技术有限公司设计合成。Step One PlusTMPCR 仪（美国Applied Biosystems 公司），Nano Drop ND-1000 微量分光光度计（美国Thermo 公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取外周血基因组DNA使用QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取试剂盒从外周血中提取基因组DNA，操作过程按照说明书步骤进行，提取的DNA于-20℃冰箱冷冻保存。采用Nano Drop ND-1000 微量分光光度计测定DNA 浓度和纯度。

1.3.2 基因分型采用TaqMan -MGB实时荧光定量PCR法进行基因分型，PCR 扩增反应体系为10 μl，内含2×TaqMan Master Mix 5.0 μl，正、反向引物各0.45 μl，TaqMan FAM 探针、Taq Man HE×探针各0.25 μl，模板DNA 1.0 μl 及无酶水2.6 μl。GSTM3 rs7483 正向引物： 5'-CAAGATGCCCATCAACAACAA-3'，反向引物： 5'-GA AACAAAACAAGCTCTGCAAGTC-3'，长度21 bp；DPYD rs1801159 正向引物： 5'-TTGATCTGGTGGACATTAGT GTAGAAA-3'，反向引物： 5'-CTGGAGTTGCGCTAGC AAGA-3'，长度27 bp；UGT1A1 rs3755319，正向引物： 5'-CAATACTTGCCCCATAGTCCATG-3'，反向引物： 5'-TACTCATTCCACTGGCCCAAGAT-3'，长 度23 bp。反应条件为95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，共40 个循环。最后60℃延伸30 s。以未加DNA 模版的无酶水反应体系作为对照组。为验证PCR 基因分型结果的准确性，随机抽取部分样品送南京骥骜生物技术有限公司进行测序。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。3 个位点多态性与结直肠癌临床病理特征的关系采用Logistic 回归分析，以比值比（）和95%可信区间（95% CI）估计各研究因素与结直肠癌进展的关系，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR 基因分型结果

3 个位点的基因分型结果见图1。由于UGT1A1 rs3755319 位点采用反向测序法，故AA 对应TT 基因型，AC 对应GT 基因型，CC 对应GG 基因型。测序结果与TaqMan-MGB 探针法的SNP 分型结果完全一致。

图1 3 个位点PCR 基因分型图与测序图

2.2 GSTM3 基因多态性与结直肠癌临床病理特征的关系

2.2.1 GSTM3 rs7483 多态性对结直肠癌临床病理特征的影响隐性模型中GSTM3 rs7483 GG 基因型在Ⅰ、Ⅱ期的频率高于Ⅲ、Ⅳ期[GG VS AA+GA：=0.466（95% CI： 0.261，0.834），P=0.010]。见表1。

2.2.2 分层分析GSTM3 rs7483 对结直肠癌临床病理特征的影响对年龄进行分层，低龄患者（≤60 岁）GSTM3 rs7483 多态性与临床病理特征无关；在高龄患者（＞60 岁）中，隐性模型中携带GG 基因型患者Ⅰ、Ⅱ期肿瘤比例是AA+GA 基因型的0.321 倍[GG VS AA+GA：=0.321（95% CI： 0.126，0.821），P=0.018]（见表2）。对性别进行分层，结果发现性别GSTM3 rs7483 与临床病理特征无关（P＞0.05）（见表3）。

2.3 DPYD 基因多态性与结直肠癌临床病理特征的关系

2.3.1 DPYD rs1801159 多态性对结直肠癌临床病理特征的影响显性模型中，AG+GG 基因型患者低分化肿瘤的比例是AA 基因型的1.398 倍[AG+GG VS AA：=1.398（95% CI： 1.004，1.946），P=0.047]。见表4。

2.3.2 分层分析DPYD rs1801159 对结直肠癌临床病理特征的影响对年龄进行分层，≤60 岁人群中，与AA型比较，AG+GG 基因型患者低分化肿瘤的频率高于中高分化[AG+GG VS AA：=1.775（95% CI： 1.132，2.785），P=0.012]，此外高龄患者中DPYD rs1801159基因型与结直肠癌临床病理特征无关（P＞0.05）（见表5）。对性别进行分层，发现女性结直肠癌患者DPYD rs1801159 与肿瘤分化程度有关系，低分化组中AG+GG 基因型的频率高于中高分化组[（AG+GG VS AA：=2.092（95% CI： 1.218，3.595），P=0.008]。此外，男性结直肠癌患者DPYD rs1801159 与临床病理特征无关（P＞0.05）（见表6）。

表1 GSTM3 rs7483 与结直肠癌临床病理特征的关系

表2 年龄分层GSTM3 rs7483 与临床病理特征的关系

2.4 UGT1A1 基因多态性与结直肠癌临床病理特征的关系

在UGT1A1 rs3755319 多态性对结直肠癌临床进展的影响中发现UGT1A1 rs3755319 与结直肠癌临床病理特征无关（P＞0.05）。见表7。

表3 性别分层GSTM3 rs7483 与临床病理参数的关系 例（%）

表4 DPYD rs1801159 与结直肠癌临床病理特征的关系

表5 年龄分层DPYD rs1801159 与临床病理特征的关系

表6 性别分层DPYD rs1801159 与临床病理特征的关系

表7 UGT1A1 rs3755319 与结直肠癌临床病理特征的关系

续表7

3 讨论

结直肠癌作为全球发病率和致死率很高的恶性肿瘤之一，已经成为危害人类健康的重大疾病[9]。基因多态性是人类基因组中最丰富的遗传变异，其可能导致个体对环境应答、机体损伤反应性、各种疾病易感性以及疾病进展的差异[10]。代谢酶是生物体内物质代谢的重要组成部分，参与各种生命活动和过程。

目前关于UGT1A1 rs3755319 的研究报道极少，其与结直肠癌的关系尚不明确。SHIN 等[11]通过生物信息学分析和荧光素酶实验，发现UGT1A1 rs3755319可能改变转录因子结合位点，降低基因的表达。据报道，接受FOLFORI（5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、伊立替康和奥沙利铂）化疗方案的晚期结直肠癌患者，UGT1A1 rs3755319 GG 比TT基因型发生3、4 级 中性粒细胞减少的毒性反应高9 倍，可能因为GG 基因型降低UGT1A1 酶活性，导致化疗药物代谢减少，体内蓄积引起副作用[12]。本研究首次分析UGT1A1 rs3755319 与结直肠癌病理特征的关系，发现UGT1A1 rs3755319 与结直肠癌临床病理特征无关。

目前关于GSTM3 rs7483 的研究较少，与结直肠癌的关系尚未阐明。MAES 等[13]研究GSTM3 与阿尔茨海默病的关系，发现GSTM3 rs7483 A 等位基因存在或者G 等位基因的缺失会降低GSTM3 mRNA 的表达水平。本研究发现，携带GSTM3 rs7483 GG 基因型患者与Ⅰ、Ⅱ期结直肠癌有关，尤其与高龄患者Ⅰ、Ⅱ分期有关，提示肿瘤进展较慢。研究表明GST 可促进各种致癌物质、治疗药物、环境毒素的解毒，因而可能延缓疾病进展，TAN 等[14]发现GSTM3 在肾细胞癌中具有抑制肿瘤的作用，rs1332018 基因变异使宿主下调肾脏中GSTM3 的表达，促进肿瘤发生，预测肾细胞癌术后不良预后。SHIOTA 等[15]研究表明，与AA 基因型比较，GG+AG 型与前列腺癌进展减慢相关。上述研究均表明GSTM3 发挥着延缓疾病进展的作用，本研究结论在一定程度上与上述结果一致。然而MEDING 等[16]研究发现，GSTM3 在发生淋巴结转移的结直肠癌患者组织中高表达。本研究与该研究结论不一致，目前关于GSTM3 与结直肠癌进展相关的研究仅有MEDING 等报道，需要进行更多的探索。综上研究，结合本研究结果，可能由于GSTM3 rs7483 GG 基因型使GSTM3 表达水平升高，在GSTM3 酶的作用下，各种致癌物和环境毒素被转化成亲水性代谢物排出体外，因而减少淋巴转移，延缓结直肠癌的进展。本研究首次发现GSTM3 rs7483 GG 基因型患者多为Ⅰ、Ⅱ期结直肠癌，提示GG 基因型携带者疾病进展可能较慢。

研究显示，DPYD 基因多态性影响DPD 的活性[17]。SHAUL 等[18]研究发现DPD 在上皮-间质转化过程中发挥重要作用，可能是肿瘤发生的机制之一。ZHANG等[6]研究发现DPYD rs1801159A＞G 降低DPD 活性，影响机体代谢化疗药物，导致化疗药物在体内蓄积引起毒性反应。QIN 等[19]发现接受化疗的乳腺癌患者中，DPYD rs1801159 AG 和GG 基因型患者的OS 和无疾病进展期比AA 基因型患者短。本研究发现携带AG和GG 基因型患者与低分化肿瘤有关，尤其与低龄和女性患者的低分化有关。可能是由于AG 和GG 基因型降低DPD 酶活性，进而影响化疗药物代谢，毒物在体内蓄积从而导致结直肠癌的恶化。

综上所述，本研究首次发现携带GSTM3 rs7483 GG 基因型结直肠癌患者多为Ⅰ、Ⅱ分期，且BMI 低下，GG 基因型携带者在Ⅰ、Ⅱ期中的频率高于Ⅲ、Ⅳ期，提示GG 基因型携带者疾病进展可能较慢。本研究还发现DPYD rs1801159 AG 和GG 基因型携带者呈现低分化，提示疾病进展可能较快，这为结直肠癌的早期预防提供依据。但由于不同种族基因型分布存在差异，部分候选SNPs 的具体分子作用机制有待深入研究，所得结论也有待更进一步的佐证。因此，在今后的研究中需要开展更大规模的人群流行病学调查，并综合考虑基因与环境的协同作用，明确SNPs 的分子机制，为判断或预测结直肠癌进展提供分子水平依据。