接种物对模拟田间厌氧发酵系统甲烷生产和秸秆降解的作用

2020-09-08陈芳清黄永文刘杨赟

环境科技 2020年4期

秦凯，陈芳清，张行，黄永文，刘杨赟

（1.湖北省三峡地区生态保护与治理国际联合研究中心，湖北宜昌 443002；2.湖北正江环保科技有限公司，湖北宜昌 443002)

0 引言

我国是农业大国，拥有丰富的农作物秸秆资源，仅2017年我国秸秆的理论资源总量就已达10.2亿t[1]。农作物秸秆作为重要的生物资源，具有多种用途，但由于我国农村燃料结构的转变，秸秆转化技术尚不成熟等原因，其利用率较低，多被遗弃或焚烧，不仅造成了资源浪费还引发了诸多环境问题[2-3]。在化石能源逐渐枯竭，能源紧张的背景下，农作物秸秆作为一种富含有机质（80%～90%）的生物质已成为一种重要的新能源[4]。厌氧发酵技术既能实现秸秆的资源化利用，又能生产清洁的生物能源，是实现农作物秸秆资源化利用的有效途径之一，国内外学者对此展开了广泛研究[5]。秸秆厌氧发酵产生物甲烷的方式可分为设施发酵（发酵罐和沼气池）和田间实地发酵[6-7]。田间实地发酵产甲烷技术是利用特制的膜系统覆盖，再通过水淹基部土壤在田间营造无氧环境，将秸秆和土壤混合后进行厌氧发酵产生物甲烷，最后通过收集系统将气体收集起来加以利用。该技术既能把秸秆转化为清洁能源，改善土壤结构，又避免了传统发酵工程中存在的运输难、成本高等问题，且经过国产化生产，其设施成本已降低了87.75%，既具生态效益又具有经济效益，具有良好的应用前景[8]。

在秸秆厌氧发酵过程中，不同的接种物因含有不同的菌群，会直接影响厌氧发酵产甲烷的进程和效率。加入充足、优质的厌氧活性微生物作为接种物可以提高秸秆厌氧发酵的降解速率和生物甲烷产量，缩短启动时间等[9]。因此，对高效接种物筛选及其作用机理研究一直是该领域的研究热点[10]。如GU 等[11]评估了牛粪沼液、猪粪沼液、鸡粪沼液3 种沼液和市政消化污泥、消化颗粒污泥和造纸厂污泥3 种污泥用作接种物和稻秆进行厌氧发酵的效果，发现沼液比污泥更适合作接种物。目前，田间实地厌氧发酵产甲烷技术的研究仅限于以稻田土壤中的微生物作为接种物来源，存在接种物单一、产气效率低下等问题[7]，尚未开展有关接种物的深入研究。为此，本研究开展了不同接种物对模拟水稻秸秆田间厌氧发酵系统甲烷生产和秸秆降解作用的研究。本研究根据田间实地发酵产甲烷技术研发的需求，在实验室内控制温度的条件下，模拟田间实地厌氧发酵系统，通过添加不同液体接种物，测定各处理累积产气量、甲烷含量和秸秆降解率的变化，揭示接种物对田间实地厌氧发酵产甲烷及秸秆降解的影响，为秸秆田间实地厌氧发酵产甲烷技术在我国的推广与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验装置与材料

1.1.1 试验装置

本试验在模拟田间实地厌氧发酵原理的发酵装置内进行，该装置包括有效容积分别为2 L 的发酵瓶和550 mL 的集气瓶。其中发酵瓶用于混装秸秆、土壤浸出液和接种物，用瓶盖密封以营造发酵无氧环境。发酵瓶瓶盖上钻出2 孔，分别作为取样孔和集气孔，用硅胶管连接集气孔与集气瓶收集产气。取样孔平日用止水夹封闭。

1.1.2 发酵原料与接种物

试验所用水稻秸秆取自湖北省枝江农科院水稻田，取回后经自然风干，切碎至3～5 cm 小段，测得总有机碳（TOC）质量分数为431.39 g/kg，总氮（TN）质量分数为8.22 g/kg，含水率为6.01%。经尿素溶液氨化预处理（使发酵底物碳氮比约为20 ∶1）5 d 后备用。为模拟田间发酵系统水淹特点及避免土壤吸附能力对试验结果造成影响，以土壤浸出液的方式添加土壤微生物，土壤取自于湖北枝江农科院长期种植水稻的稻田，取回后参照杨军等[12]的方法，以1 kg 土壤添加1 L 去离子水浸泡，搅拌均匀，待充分浸出后，静置过滤，留取清液备用。试验所用的接种物为沼液和猪粪浸出液，沼液和猪粪取自湖北枝江农科院沼气池和养殖场。猪粪取回后参照杨军等[12]的方法进行猪粪浸出液的制取，以1 kg 新鲜猪粪添加1 L 去离子水浸泡，搅拌均匀，静置过滤。接种物均滤去残渣，留其清液备用。试验材料的特性见表1。

表1 发酵原料与接种物的特性

1.2 试验设计

试验以接种物种类为试验因子，接种物处理包括500 mL 的沼液和猪粪浸出液、以及500 mL 体积比为1 ∶1 的沼液+ 猪粪浸出液混合液，分别标记为A，B，C。另外还设置添加等体积500 mL 去离子水的对照组，标记为CK。每个处理水平均设置3 个重复，共计12 组试验。以经氨化预处理5 d 后的水稻秸秆为原料，干物质质量均为80 g，添加500 mL 稻田土壤浸出液作为环境基质，然后分别添加上述接种物，混匀后密封置于30±1 ℃恒温气候箱内进行厌氧发酵试验。根据湖北地区一般于4月中下旬到9月中下旬大面积种植中稻的特点，农闲期较长，整个发酵试验为期90 d，试验期间每日观察产气情况，并记录相关参数。

1.3 测定指标与方法

在试验前分别测定了发酵原料的TOC，TN，TS和原料挥发性固体（VS）。其中TOC 用K2Cr2O7-外热源法测定，TN 采用全自动凯氏定氮仪测定，TS 的测定用干燥恒重法，VS 的测定用灼烧恒重法。厌氧发酵期间每5 d 对各处理的产气量和甲烷含量进行测定，产气量测定方法为排水法，甲烷含量测定用气相色谱法，同时吸取少量发酵液利用比色法测定其挥发性脂肪酸（VFAs）质量浓度。并在氨化预处理前后和整体试验后分别从各处理取秸秆样品测定其纤维素、半纤维素和木质素含量，测定方法分别为72%浓硫酸水解法、2 mol/L 盐酸水解法和浓硫酸法。秸秆木质纤维素降解率和总降解率的计算公式如下：

式中：Rh为秸秆木质纤维素降解率，%；S0为处理前木质纤维素质量分数，%；Se处理后木质纤维素质量分数，%；Rd为秸秆总降解率，%；m0为处理前秸秆干物质质量，g；me为处理后秸秆干物质质量，g。

1.4 数据分析

采用Excel 2010 软件对数据进行统计与初步分析，以平均值绘制曲线图，分析不同接种物厌氧发酵进程中甲烷产气量、甲烷含量、pH 值、VFAs 质量浓度的动态变化；以接种物种类为变量，以90 d 发酵试验的累积产气量、TS 产气率和秸秆木质纤维素含量为因变量，采用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析，分析接种物种类对厌氧发酵产气和秸秆降解的影响，当单因子作用效果影响达到显著水平时（p＜0.05），采用S-N-K 法进行多重比较，分析各处理之间的差异水平。

2 结果与分析

2.1 接种物对水稻秸秆厌氧发酵产甲烷进程的影响

各试验组甲烷产气量、甲烷含量、VFAs 质量浓度和pH 值随时间变化均呈大致相同的变化趋势见图1。由图1 可知，甲烷产气量呈下降-上升-下降的变化，甲烷含量呈上升-下降的变化，pH 值则呈下降-上升的变化，而VFAs 呈上升-下降的变化。接种物种类对水稻秸秆厌氧发酵产甲烷进程有一定影响。因接种物厌氧发酵菌群的不同，各处理相关参数峰值出现的时间、峰值的大小均有差异。图1（a）中甲烷产气量方面，对照值（CK）处理在第25 天才开始产气，其余处理在第5 天即开始产气，但经历了10～25 d 的产气停滞期。随后各处理进入产气高峰期，峰值出现在第35～55 d 之间。在甲烷产气量方面以A 处理的峰值最高（336.78 mL），以CK 处理的峰值最低（115.04 mL），前者比后者高192.75%；图1（b）中甲烷含量方面，以A 处理的峰值最高（69.62%），以CK 处理的峰值最低（53.17%），前者比后者高30.94%。

图1 不同接种物对厌氧发酵的影响

图1（c）中VFAs 质量浓度方面，各处理在厌氧发酵第10 d 时有一个高峰，随后A 和B 处理VFAs质量浓度开始下降，而C 和CK 处理则继续上升。以C 处理的峰值最高（4.33 g/L），以CK 处理的峰值最低（3.18 g/L），前者比后者高36.16%；图1（d）中pH值方面，不同试验组pH 值的变化范围有较大差异，A 和B 处理pH 值变化范围较小，分别在6.38～7.48和6.22～7.47；C处理的pH值变化范围在5.82～7.39；CK 处理的pH 值变化范围最大，在5.43～7.18。

2.2 接种物种类对水稻秸秆厌氧发酵累积产气量和产气率的影响

接种物种类对水稻秸秆厌氧发酵累积产气量和TS 产气率存在的显著影响（p ＜0.05）见图2。由图2可知A 和B 处理对水稻秸秆厌氧发酵产气具有促进作用，相比于CK，A 处理累积产气量和TS 产气率提高了70.82%，B 处理累积产气量和TS 产气率提高了42.66%。C 处理对累积产气量和TS 产气率均无显著影响（p ＞0.05），累积产气量和TS 产气率相比CK 组仅提高了4.28%。

图2 不同接种物对厌氧发酵累积产气量和产气率的影响

2.3 接种物种类对水稻秸秆降解的影响

接种物种类对水稻秸秆的木质纤维素含量和干物质质量的显著影响（p ＜0.05）见表2。经厌氧发酵后，秸秆纤维素和半纤维素被厌氧微生物大量分解，其含量大幅降低，而木质素因难以降解其含量反而升高。A，B，C 各处理纤维素降解率分别为42.20%，39.39%和32.06%，而CK 仅为21.46%；A，B，C 各处理半纤维素降解率分别为42.70%，34.78%和40.61%，CK 仅为30.04%；A，B，C 各处理秸秆总降解率分别为54.71%，54.29%和41.79%，CK 仅为30.30%。各处理中以A 处理的纤维素降解率、半纤维素降解率和总降解率均最高，相比CK 组分别提高了96.64%，42.14%和80.56%。

表2 添加不同接种物对厌氧发酵秸秆成分的影响

3 讨论

3.1 接种物种类对厌氧发酵进程的影响

厌氧发酵产生物甲烷是一个复杂的进程，包括水解酸化、产氢产乙酸和产甲烷等3 个阶段[13]。在水解酸化阶段，先由水解菌将木质纤维素等复杂聚合物水解为单一或较复杂的化合物，再由酸化菌将其分解为单糖、氨基酸、脂肪酸等产物。在产氢产乙酸阶段，产酸菌进一步将各种脂肪酸降解为乙酸、二氧化碳和氢气。在产甲烷阶段，产甲烷菌主要利用乙酸、氢气、二氧化碳等简单的物质生产甲烷以及合成自身的细胞物质。以上3 个阶段非产甲烷菌和产甲烷菌间通过协同作用、拮抗作用共同维系厌氧发酵微生物群落的稳定性，任何阶段微生物种类和数量发生变化，都会对厌氧发酵进程产生影响[14]。

本试验中，添加接种物后，各处理对产气量和产甲烷含量的变化趋势没有改变，但是各处理产甲烷启动时间、停滞期、峰值出现的时间、峰值的大小均有较大变化，其同期的pH 值和VFAs 质量浓度也发生相应的变化。出现差异的原因是不同接种物所含有的微生物类群的差异所导致的[15]。添加单一沼液和猪粪浸出液的处理，接种物均含有由产甲烷菌和非产甲烷菌组成的厌氧发酵菌群，如能够降解有机物的厚壁菌门，能利用所有产甲烷途径的甲烷八叠球菌属等，但其优势菌群的差异导致发酵进程有所差异。接种物的添加不仅能改善厌氧发酵微生物菌群结构，还能抑制脂肪酸的累积，有利于快速启动厌氧发酵和提高甲烷产量[16]，因此其厌氧发酵产甲烷启动速度、产甲烷峰值和甲烷含量均显著高于对照。添加混合接种物的处理，虽然在启动速度、产甲烷峰值方面均高于对照，但在缓解酸累积方面却低于对照。其原因可能是混合接种物使微生物群落失去平衡，接种物和发酵基质中的酸解菌种类和数量较多，产甲烷菌的种类和数量较少，发酵基质分解较快，产生酸累积。由于产甲烷菌最适pH 值在6.8～7.2，酸累积导致产酸菌活性高于产甲烷菌，VFAs 过量累积。

3.2 接种物种类对秸秆降解和甲烷生产的影响

秸秆中主要的化学成分是木质纤维素，纤维素和半纤维素被疏水的木质素层紧密包裹,且木质素最难以被微生物降解利用，因此秸秆的水解是厌氧发酵的限速步骤，影响秸秆的转化效率[17]。秸秆厌氧发酵降解和产甲烷的过程是一个产甲烷菌和非产甲烷菌相互作用，相互制约的过程：①在厌氧发酵中，厚壁菌门够降解复杂有机物，拟杆菌门和变形菌门则是水解和产酸的主要菌群[18]，这些水解菌和酸化菌等微生物促进秸秆降解为单糖、氨基酸、脂肪酸等产物。秸秆的降解本身受水解菌和酸化菌的影响，提高水解菌和酸化菌的数量与活性能促进秸秆的分解；②秸秆降解可为产甲烷菌提供可供利用的小分子和众多副产物，如VFAs，NH4+，H2S 等，若小分子和众多副产物能及时被产甲烷菌利用形成甲烷，则秸秆的降解和甲烷的生产都会顺利进行。但是当小分子和众多副产物不能被产甲烷菌利用形成甲烷，则会导致中间产物的累积，抑制水解菌和酸化菌的生长与活性，从而影响对秸秆的分解与利用。

已有的研究表明，混合微生物菌群间的协同作用能更好地促进生物质固体废物的厌氧消化，是提高生物质固体废物可降解性的有效途径。本试验中添加接种物的各处理纤维素、半纤维素的降解率和总降解率均显著高于对照组，其中以添加沼液和猪粪浸出液对秸秆的降解效果最好。接种物的添加还能提高累积产气量，其中也以添加沼液和猪粪浸出液的单一接种物处理最为显著，其TS 产气率也显著高于对照组。其原因是接种物中所含有的水解菌、酸化菌和产甲烷菌构成了稳定的厌氧发酵菌群，使秸秆得到更彻底的分解[16]。混合接种物对秸秆的降解效果和累积产气量虽高于对照组，但却低于单一接种物处理，其原因可能是混合接种物的微生物菌群不具有互补性，并存在拮抗作用。这种作用使得非产甲烷菌和产甲烷菌处于不稳定的非平衡状态，产甲烷菌的作用受到影响，最终影响秸秆的降解和甲烷的生产效率。本实验中，各处理所含微生物种类的具体差异及其效应将另外成文进一步分析。