蒋 靓，张光波，谢金晶，李维洁，汤龙海

（苏州市中心血站检验科，江苏215006）

血小板输注已成为现代输血医学的主要内容之一，在白血病、DIC 等血液系统疾病的治疗中发挥重要作用，而输注前血小板的活化状态直接影响临床效果。研究表明，使用血细胞分离机（Trima）制备的单采血小板稳定性好、活化水平最低，因此得到广泛使用[1]。有较多的研究表明，高脂血症患者血浆中低密度脂蛋白（LDL）水平升高易促进血小板活化聚集，引起动脉粥样硬化和炎症反应[2-3]。本实验旨在探究单采血小板血浆中高水平LDL 是否对不同保存时间下血小板活化指标 CD63、CD36、CD40 及 CD62p 表达产生影响，为临床血小板输注提供参考意见。

1 资料与方法

1.1 一般资料 苏州市中心血站2019 年4 月—6月无偿捐献单采血小板供者35 名，均男性，年龄为25～40 岁，平均31 岁，符合国家规定的献血者体检标准。同时满足以下要求：采前外周静脉血血小板达到（150～449）×109/L；2 次采集间隔时间≥14 天；采集前72 h 内未服用阿司匹林类药物。根据捐献者低密度脂蛋白水平分为升高组（LDL≥3.4 mmol/L）5 例（范围 3.47～5.14 mmol/L，中位数 3.9 mmol/L）和正常组（LDL＜3.4 mmol/L）30 例（范围 0.32～3.37 mmol/L，中位数0.925 mmol/L）。本研究经本血站伦理委员会审批，所有献血者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 采集和保存血小板：由血细胞分离机经LDPLP 程序以滤白法采集血小板。血小板采集设定量为≥2.5×1011/袋，容量设定为 250～300 mL，同时进行血小板质控检测，质量符合单采血小板国家质量标准。利用单采血小板的留样袋，每份留取血小板10 mL，置于（22±2）℃水平振摇血小板保存箱保存，分别于第2、3、4、5 天留取标本进行检测，并取出部分标本使用小留样袋或EP 管分装，于室温下静置，然后于0 min、30 min、60 min、120 min 各时间点上流式细胞仪检测血小板活化指标。

1.2.2 流式细胞术检测血小板活化指标：用磷酸盐缓冲液调整血小板浓度为（1～3）×109/L 血小板悬液，吸取 20 μL 血小板悬液与 CD63-FITC、CD36-PE、CD40-FITC、CD62p-PE 荧光抗体（Biolegend，达科为生物技术有限公司，上海）室温下避光孵育15 min，加入1 mL 4%多聚甲醛固定，流式细胞仪（Beckman Coulter，FC500，美国）检测荧光强度。

1.3 统计学处理 使用EXCEL 软件和SPSS 11.0统计学软件进行数据处理分析。血小板活化指标检测数据以中位数表示，两组间比较采用非参数Wilcoxon 检验，多组间比较采用Friedman 检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 血小板活化指标的表达 与同型对照组相比，LDL 正常组及升高组血小板均有不同程度CD63、CD36、CD40、CD62p 表达（图 1）。

图1 血小板表面表达CD63、CD36、CD40 和CD62p

2.2 不同保存时间两组血小板活化指标表达率比较 在不同保存时间下，LDL 升高组血小板CD63、CD36、CD40 及 CD62p 的表达率与 LDL 正常组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同保存时间两组血小板活性指标表达率比较（%）

2.3 不同室温静置时间下两组血小板活化指标表达率比较 由于血小板临床输注在室温下进行，因而需要比较不同保存时间的血小板室温静置0 min、30 min、60 min、120 min 时活化指标表达率，结果显示保存第2、3、4、5 天的血小板经室温不同静置时间，LDL 升高组与 LDL 正常组比较，CD63、CD36、CD40 以及CD62p 表达水平的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2、表 3、表 4、表 5。

表2 两组保存第2 天血小板经室温不同静置时间后活性指标表达率比较（%）

表3 两组保存第3 天血小板经室温不同静置时间后活性指标表达率比较（%）

表4 两组保存第4 天血小板经室温不同静置时间后活性指标表达率比较（%）

表5 两组保存第5 天血小板经室温不同静置时间后活性指标表达率比较（%）

3 讨 论

高脂血症表现为高胆固醇和/或高甘油三酯，与心脑血管疾病和血栓性疾病发生有关。有研究指出，高胆固醇血症会致使血小板寿命缩短，且黏附、聚集以及释放反应增强[4]。庄爱周等[5]探讨总胆固醇和三酰甘油对血小板各参数的影响，指出不论是血脂单项升高或者混合升高，均可显著改变PLT 数和血小板平均体积（MPV），提示在高脂血症环境下血小板易被激活。研究表明，高胆固醇血症通过血小板ADP受体-P2Y12 途径促进血小板活化[6-7]。LDL 作为心血管疾病的危险性因素在血小板活化中的作用及具体机制尚未明确。随着分子生物学和免疫学的发展，对血小板表面活化标志物进行了广泛研究。血小板表面 CD63、CD36、CD40 和 CD62p 均可作为血小板活化标志物[8-10]，其中CD62p 是血小板活化过程中释放最多的颗粒膜糖蛋白，能够准确反映血小板活化程度。陈乐闻[6]研究显示，高LDL-C 患者血小板CD62p和PAC-1 的表达显著升高，经他汀类药物治疗后CD62p 和PAC-1 的表达显著降低，反映高LDL-C 能激活血小板的活化聚集功能。吴延庆等[11]不仅在体内观察到血浆LDL-C 与血小板膜PAC-1 及CD40L 表达存在线性相关，而且在体外也发现高LDL-C 血浆与血小板孵育可显著增加血小板膜PAC-1 及CD40L 表达水平，表明高LDL-C 水平与血小板的免疫活化有关。但迄今为止尚未有针对单采血小板血液标本LDL 升高对血小板免疫活化影响的研究。

本血站单采血小板年供应约35 000 个治疗量，由于血小板保存期短，易被激活，所以血小板制备、保存与活化的问题备受关注[2]。体外血小板活化状态直接关系患者的临床输注效果。目前献血者初筛检测指标未涉及血脂4 项，对于血脂浓度升高者对血小板的影响尚不清晰。本研究对单采血小板血液标本中LDL 水平与血小板各活化指标的关系进行分析，结果显示正常献血员血小板标本均有CD63、CD36、CD40 和CD62p 的表达，在保存期内血小板的活化状态未受影响。在同一保存条件下的不同保存时间内，LDL 升高组血小板各活化标志物的表达水平与LDL 正常组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。由于健康献血员中LDL 水平升高者的比例低，且LDL 多属于边缘升高，与临床高脂血症患者LDL 的异常升高水平不同，尚不足以有效激发血小板免疫活化，从而不会影响临床输注效果。有研究表明，高浓度LDL 能显著增加ADP 激活的血小板表面PAC-1 及CD40L 的表达，促进血小板的聚集，推测LDL 可能通过增强血小板激活剂间接促进血小板在某些特定条件下的活化[11]。高脂血症患者可能伴有氧化修饰型LDL（OX-LDL）及某些炎症介质水平的升高，两者能直接刺激血小板活化，从而介导动脉粥样硬化炎症的发生[11-15]。而正常献血者体内免疫系统正常，不存在炎症介质等应激状态，即便血浆LDL 水平些许升高，但是OX-LDL 水平正常，因而不会对血小板免疫活化产生影响。另外，临床高脂血症患者需空腹抽取血液标本进行血脂的检测，而无偿献血者不能空腹抽取血液标本，因此其LDL 水平还与献血前饮食有关。

综上所述，在不同保存时间内单采血小板献血员血浆LDL 水平与血小板免疫活化无关，高LDL 水平不影响血小板的活化状态，从而不影响临床输注效果。今后我们将继续扩大单采血小板LDL 水平升高组的样本量，并进行体外实验，研究在炎症介质、ADP 等激活剂的作用下血浆LDL 升高对血小板活化的影响。