杨开颖 代诗懿 邱桐 周江元 陈思源 吉毅

1四川大学华西医院小儿外科，成都610041；2四川大学华西医院重症医学科，成都610041

婴儿血管瘤（infantile hemangioma，IH）是婴幼儿最常见的良性肿瘤，发病率为4%～5%［1］。绝大多数IH 可自然消退，但仍有10%～15%的IH 可引起严重并发症［2］。研究表明，血管发生与血管生成均参与IH的发病过程，但确切机制尚不清楚［3］。目前，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）已被证实在内皮细胞分化及血管生成等方面发挥重要调控作用［4］。本研究旨在通过基因芯片技术分析增殖期与消退期IH的lncRNA差异表达情况，并利用生物信息学技术分析lncRNA 参与调控IH发病的机制。

对象与方法

一、对象

2019年1-3月在四川大学华西医院小儿外科行手术切除治疗（在向所有患儿家属介绍如口服普萘洛尔等非手术治疗的前提下，家属综合考虑后首先选择手术切除治疗）的8 例IH 组织（表1），所有患儿在术前均未采取过任何治疗措施。术中将切下标本组织分成两份，一份立即转运至-80 ℃冰箱长期储存；另一份用于病理诊断及分期。经HE 染色（图1）和免疫组化葡萄糖转运蛋白1（GLUT-1）染色（图2）分析，结合临床特征，依据文献［5］确诊增殖期与消退期各4 例。其中，增殖期IH 颜色鲜艳，瘤体会逐渐生长并凸出体表，表面张力大；消退期IH颜色暗红，瘤体逐渐缩小变软，中心可以缓慢退化变白。本研究获得四川大学华西医院伦理委员会批准（批件号：2017414），取材前所有患儿家属签署知情同意书。

二、方法

1.RNA提取和lncRNA与mRNA表达谱芯片制备：采用Trizol试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司）提取组织中总RNA，采用miRNeasy Minikit试剂盒（美国Qiagen 公司）将RNA 提纯，使用Nano Drop 2000（美国Thermo Fisher Scientific 公司）分光光度计对RNA 进行定量，同时进行琼脂糖凝胶电泳质检，最终将制备的RNA样本储存于-80 ℃液氮中备用。采用Affymetrix GeneChip Human Transcriptome Array 2.0二代高通量芯片（美国赛默飞世尔科技公司）分析增殖期与消退期IH lncRNA与mRNA的差异表达谱，包含245 000余条mRNA探针和40 000余条lncRNA探针。每个标本都进行标准化的芯片上样处理。基因芯片探针设计由上海其明科技有限公司完成。

表1 8例婴幼儿局灶性混合型血管瘤临床相关资料

图1 婴儿血管瘤皮损病理表现（HE×400） 1A：增殖期血管瘤内皮细胞高度增殖，血管管腔密集，罕见脂肪组织；1B：消退期血管瘤内皮细胞逐渐成熟，血管团块逐渐形成管腔结构，血管管腔粗大肥厚，脂肪组织浸润增多 图2 免疫组化检查（葡萄糖转运蛋白1 染色×400） 2A：增殖期血管瘤血管内皮细胞染色阳性且丰富表达；2B：消退期血管瘤血管内皮细胞表达葡萄糖转运蛋白1，但表达强度减少

2.生物信息学分析：①通过基因芯片筛选得到差异表达的lncRNA 与mRNA（筛选标准：P ＜0.05，差异倍数＞1.5）；②对差异表达mRNA 进行GO 功能和KEGG 通路富集分析；③构建lncRNA-mRNA共表达网络，以相关系数＞0.97 或＜-0.97 及P ＜0.05 为标准进行lncRNA 靶基因筛选，并用Cytoscape 软件对其进行可视化处理；④对lncRNA靶基因进行GO和KEGG分析，以预测lncRNA功能作用。以上分析在上海其明公司GCBI（https：//www.gcbi.com.cn/）平台完成。

3. 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证：采用SYBR Green qPCR方法，验证增殖期与消退期IH组织中部分差异lncRNA 与mRNA 的表达，重复3次。采用TRIzol 试剂提取组织中总RNA 后进行核酸定量，参照cDNA 合成试剂盒说明书进行反转录，选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，引物序列详见表2。qPCR（美国赛默飞世尔科技公司）实验反应条件为：95 ℃30 s；95 ℃15 s，60 ℃30 s共40个循环，最后做熔解解曲线分析。每份样品重复检测3次，采用2-△△Ct法计算差异lncRNA 与mRNA的相对表达量。

4.统计学分析：采用SPSS 23.0 软件进行数据统计分析，连续性变量用±s 表示，采用独立样本t 检验比较组间差异（P ＜0.05，差异倍数≥1.5）。P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、增殖期和消退期IH差异表达的lncRNA与mRNA

以消退期IH 组织为参照组，增殖期IH 中共筛选出405条差异lncRNA，其中108条下调，297条上调，同时筛选出772 条差异mRNA，其中107 条下调，665 条上调（图3）。前20 条差异lncRNA 与前30条差异mRNA分别见表3和表4。

二、增殖期和消退期IH差异mRNA的GO功能与KEGG通路富集分析

GO 功能分析显示，差异mRNA 主要参与血管凝固、轴突导向、血管生成和细胞黏附以及对缺氧反应、凋亡过程、细胞增殖负调控等生物过程；KEGG 通路分析发现，差异mRNA 主要富集在代谢通路、细胞局部黏附、肌动蛋白细胞骨架调控、白细胞跨内皮迁移、磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）、血管平滑肌收缩等信号通路（图4）。

三、增殖期和消退期IH lncRNA-mRNA 共表达网络

经Cytoscape 可视化处理后生成的lncRNAmRNA 共表达网络由370 个节点及1 244 条关系组成。为更好地展示lncRNA-mRNA 共表达网络关系，选取度值（degree，一个点的度指图中该点所关联的边数）≥15的差异lncRNA和mRNA构建相互作用网络，该网络由81个节点（23条mRNA和58条lncRNA）及269条关系组成。从此网络中可知，1条lncRNA 可同时与多条mRNA 发生相互作用关系（图5）。

四、增殖期和消退期IH lncRNA靶基因预测

结合lncRNA-mRNA共表达网络，对lncRNA进行靶基因顺式作用（cis）预测。通过寻找lncRNA上下游10 kb 范围之内的mRNA，以相关系数＞0.97或＜-0.97 及P ＜0.05 为标准共筛选出18 对lncRNA-mRNA（表5）。对这些lncRNA预测的靶基因进行GO 功能及KEGG 通路分析，发现这些基因主要富集在“正向调控神经元分化”、“正向调控细胞分化”及“细胞膜电位调控”等生物过程以及“胰腺分泌信号通路”与“环腺苷酸信号通路”等。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

图3 增殖期和消退期婴儿血管瘤差异表达的lncRNA（3A）与mRNA（3B）聚类图 P：增殖期；I：消退期。在增殖期血管瘤中表达上调的lncRNA或mRNA均要比消退期多

表3 增殖期和消退期婴儿血管瘤前20条差异（P ＜0.001）表达的lncRNA

表4 增殖期和消退期婴儿血管瘤前30条差异（P ＜0.001）表达的mRNA

图4 增殖期和消退期婴儿血管瘤前20条差异表达的mRNA GO功能（4A）及KEGG通路（4B）富集结果

图5 度值（degree）≥15 的lncRNA-mRNA 共表达网络图●代表mRNA，代表lncRNA；红色代表上调，黄色代表下调。1条lncRNA可同时与多条mRNA发生相互作用关系

表5 增殖期和消退期婴儿血管瘤差异表达的lncRNA靶基因预测

五、qRT-PCR验证结果

随机选择差异表达的4 条lncRNA（n335248、ENST00000450864、n333319 和n335185）与4 条mRNA（EDNRA、IFI6、HK2 与ITGA1）进行qPCR 验证，结果与芯片检测结果一致。见图6、表6。

讨 论

图6 qRT-PCR 结果验证增殖期和消退期婴儿血管瘤差异表达的lncRNA 与mRNA 1：IFI6；2：HK2；3：ITGA1；4：EDNRA；5：n335248； 6：n333319； 7：n335185； 8：ENST00000450864。Microarray：基因芯片；qRT-PCR：实时荧光定量PCR

表6 实时荧光定量PCR检测增殖期和消退期婴儿血管瘤差异表达的lncRNA与mRNA（±s）

表6 实时荧光定量PCR检测增殖期和消退期婴儿血管瘤差异表达的lncRNA与mRNA（±s）

注：n=3

mRNA/lncRNA IFI6 HK2 ITGA1 EDNRA n335248 n333319 n335185 ENST00000450864增殖期1.25±0.20 0.93±0.14 0.47±0.38 1.20±0.19 0.54±0.46 0.50±0.36 1.16±0.21 1.33±0.30消退期0.68±0.33 1.51±0.83 0.29±0.04 0.66±0.17 0.18±0.09 0.25±0.21 0.98±0.46 2.32±0.99 t值3.13-1.39 0.80 4.12 1.70 1.11 0.58-2.37 P值0.020 0.254 0.455 0.006 0.126 0.304 0.583 0.398

IH 是婴幼儿时期最常见的良性肿瘤，具有典型的生长特征，即先快速增殖后缓慢消退［2］。研究表明，多条通路及多种基因参与IH 的发病过程［6］，但是IH 从增殖期向消退期演化的机制仍然不明。随着二代测序技术的发展，基因芯片越来越广泛地用于辅助临床疾病的诊断与治疗。lncRNA 是长度＞200 个核苷酸的分子，不具有编码蛋白质功能。研究表明lncRNA 可以参与多种生物学功能，如在转录前、转录后调控mRNA 表达，从而影响细胞增殖、分化、凋亡和迁移，发挥调控血管生成的作用［7-8］。然而，lncRNA在IH中的表达情况及其所发挥的功能目前仍不清楚。为了更好地研究IH 中lncRNA 的作用，我们通过对比增殖期与消退期IH组织中lncRNA 与mRNA 的差异表达情况，结合生物信息学技术，筛选出与IH 发生发展相关的lncRNA 与mRNA，同时构建lncRNA-mRNA 共表达网络。该共表达网络表明，lncRNA 与mRNA 之间的联系并不是简单的一一对应关系。1 条mRNA可以由多条lncRNA共同调节，同样地，1条lncRNA也可以作用于多条mRNA。这进一步佐证了IH 发病机制及发生发展过程的复杂化。通过lncRNAmRNA 共表达网络，我们对lncRNA 靶基因进行预测，如lncRNA n405879靶基因RAB11A可以通过调控表皮生长因子的表达影响细胞分化［9］，这为进一步深入探讨血管瘤的发病机制提供了新方向。

本研究中，共筛选出445 条差异lncRNA 与772 条差异mRNA，这些差异基因不仅包括已经被证实参与调控IH 发病机制的重要基因，如DLL4、HIF1A、JAG1、HEY1 及PDGFRB 等［10-11］，可参与Notch 信号通路，调控血管内皮细胞的增殖与迁移［6］，还包括许多尚未发现与IH 相关的基因，如与血管生成相关的基因LEPREL1、RAMP2 及SERPINE1 等［12-14］，它们可能在IH 发生发展过程中调控血管瘤内皮细胞的增殖、分化等，从而调控IH血管生成。GO 功能富集显示，差异基因除了富集在血管生成、细胞黏附、对缺氧刺激反应等所熟知的参与IH发病机制的功能外［3］，还富集在一些尚未在IH 领域内被深入研究的新的生物功能，如血液凝固与血小板激活及肌动蛋白细胞骨架等。既往研究显示，消退期IH 比增殖期IH 中Ⅲ型胶原蛋白和层黏连蛋白大量沉积［15］，普萘洛尔可以通过降低细胞外基质蛋白（基质金属蛋白酶9）的表达，从而抑制血管瘤内皮细胞血管生成［16］，这些功能均有报道与肿瘤生长存在联系［17-18］。

同样，本研究中KEGG 通路分析显示，差异基因除富集在局部黏附通路、PI3K-Akt信号通路及细胞黏附分子通路等已知的与IH发生发展相关的通路外，还富集在代谢通路、肌动蛋白骨架调控通路、血管平滑肌收缩通路及胰岛素信号通路等尚未在IH发病机制中被深入研究的通路。如参与代谢通路的HK2基因，其作为糖酵解通路的关键酶之一，可以通过促进乳酸产生从而调控肿瘤生长与迁移［19］，同时研究显示，PI3K-Akt 信号通路可以通过调控HK2的表达发挥抑制细胞凋亡和促进肿瘤生长的作用［20］，这表明HK2 所参与的糖代谢通路很有可能也在IH发生发展过程中发挥作用。以上结果表明，多种差异基因可能参与多个生物过程以及多条信号通路，共同发挥对IH 发生发展过程的调控。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突