罗茂 罗卓夫 毕建军 许飏

1西南医科大学附属医院皮肤科，四川泸州646000；2重庆市渝北区人民医院皮肤科401120

罗茂现在重庆市渝北区人民医院皮肤科

恶性肿瘤的发生演进与细胞生长、凋亡、自噬、物质及能量代谢等异常密切相关，线粒体在调节这些生物过程中发挥重要作用，其功能异常与肿瘤发生发展的相关性已成为抗癌研究的热点之一［1］。三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATPase family AAAdomain containing protein 3A，ATAD3A）是一种定位于线粒体内膜的ATP 酶，具有ATP 酶的活性，对维持线粒体结构、功能以及线粒体与内质网之间的相互作用至关重要［2-3］，在细胞能量代谢、物质合成、自噬、凋亡等生理过程中发挥重要作用［4-5］，其功能异常与肿瘤等疾病的发生演进密切相关［6］。近年研究显示，ATAD3A 在肺癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤组织中过表达，并与肿瘤分期、组织学分级、生存预后等临床病理特征密切相关，可增强肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并诱导化疗抵抗，其机制涉及在乏氧状态下为肿瘤细胞增加能量供应，抑制自噬、凋亡，促进细胞周期进展以及调节一些肿瘤促进蛋白的表达而影响肿瘤的发生发展等［7-10］。黑素瘤的发病机制未明，涉及上述多种机制的异常［11］，而ATAD3A在黑素瘤恶性进展中的作用尚未见报道。本实验旨在初步探讨ATAD3A 在黑素瘤组织中的表达情况以及沉默ATAD3A 对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响，为研究ATAD3A 在黑素瘤发生发展中的作用提供理论依据和参考。

材料与方法

一、组织、细胞与主要试剂

2019 年8-12 月在重庆市渝北区人民医院皮肤科收集3 例黑素瘤患者的黑素瘤组织及其癌旁组织。3例患者中，1例为45岁男性，左上臂发生黑素瘤，1 例为63 岁女性，会阴部发生黑素瘤，1 例为女52 岁性，右足拇趾发生黑素瘤。本研究取得重庆市渝北区人民医院伦理委员会同意（批件号：2019061）。黑素瘤A375细胞产自中国科学院上海细胞库。沉默ATAD3A 慢病毒和空载对照慢病毒由苏州吉玛基因股份有限公司包装。The fast200 KIT产自上海飞捷生物技术有限公司，Prime Script™RT Master Mix 及SYBR®Premix ExTaq™产自大连TaKaRa公司。兔抗人ATAD3A单克隆抗体产自英国Abcam 公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、SRY 基因相关的高迁移率族蛋白盒2（SOX2）、NANOG、八聚体结合蛋白4（OCT4）、波形蛋白、SLUG、基质金属蛋白酶2（MMP2）单克隆抗体均产自美国CST 公司。CCK-8 试剂产自日本同仁化学研究所。BCA 蛋白测定试剂盒产自北京碧云天生物技术公司。Transwell 小室和基质胶产自美国赛默飞公司。

二、方法

1.细胞培养：将生长状态良好的A375 细胞培养于含10%胎牛血清的1640 培养基中，置于5%CO2、37 ℃培养箱培养。细胞密度达80%～90%融合时换液及传代。

2.慢病毒的感染和筛选：将A375 细胞悬液接种到6 孔板培养，每孔1 ml 含1×105个细胞，当细胞达60%融合时，向3 个孔内加入2 μl 滴度为1 ×108TU/ml的沉默ATAD3A慢病毒液，另外3孔内加入2 μl 滴度为1 × 108TU/ml 的空载对照慢病毒液。培养48 h 后，在荧光显微镜下观察荧光强度，用嘌呤霉素筛选稳定感染细胞株。将稳定感染沉默ATAD3A 慢病毒和阴性对照慢病毒的细胞分别记为shATAD3A组和shCtrl组。

3.实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）验证慢病毒感染效率：当shATAD3A、shCtrl 两组细胞融合度70%～80%时，使用the fast200 试剂盒提取总RNA，使用Prime Script™RT Master Mix试剂盒进行反转录获得cDNA，体系如下：5 × Prime Script™RT Master Mix 8 μl，总RNA 2 μg，DEPC水30 μl，总体积40 μl，反转录条件：37 ℃反转录30 min，85 ℃灭活5 s，4 ℃保存。PCR 扩增反应体系：SYBR®Premix ExTaq™5.0 μl，正向引物和反向引物各0.4 μl，cDNA 1.0 μl，DEPC 水3.2 μl，总体积10 μl，离心混匀后，按以下条件行PCR扩增：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，85 ℃延伸5 s，以上变形、退火、延伸3 个步骤循环45 次，70 ℃～95 ℃，每秒升温0.4 ℃以分析熔解曲线。以GAPDH作为内参，根据反应的Ct值，以2-△△Ct法计算mRNA表达量。引物序列：ATAD3A正向引物为5′-GCGA GCCACCGAGAAGATAAG-3′，反向引物5′-TGGAC CATCTCATTGATGCGG-3′；GAPDH正向引物5′-GG AGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物5′-GGCT GTTGTCATACTTCTCATGG-3′。实验重复3次。

4.Western 印迹检测黑素瘤组织及shATAD3A组和shCtrl 组细胞中相关蛋白的表达情况：将黑素瘤组织和癌旁组织以研钵研磨成组织匀浆后，采用蛋白裂解液提取蛋白；常规消化对数生长期shATAD3A组和shCtrl 组A375细胞，收集裂解提取蛋白液。采用BCA法测定蛋白浓度，将含20 μg蛋白的蛋白液加入10%聚丙烯酰胺凝胶孔内进行恒流10 mA 电泳。使用甲醇活化的聚偏二氟乙烯膜转膜。室温摇床封闭2 h。加入按1∶100比例稀释的 兔 抗 人ATAD3A、GAPDH、SOX2、NANOG、OCT4、波形蛋白、SLUG、MMP2 单克隆抗体4 ℃孵育过夜；加入稀释度为1∶1 000 的山羊抗兔抗体室温孵育1 h。采用ECL 发光液显色，放入凝胶成像仪中成像分析，内参为兔抗人GAPDH。同时采用美国National Institutes of Health（NIH）的Image J软件分析Western 印迹的条带灰度值，目的蛋白的相对表达量=目标蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。实验重复3次。

5. 克隆形成实验检测A375 细胞克隆形成能力：将生长状态良好的shATAD3A、shCtrl 两组细胞消化稀释成细胞悬浮液，接种到6孔板，每孔200个细胞，培养1周后，用10%多聚甲醛固定，结晶紫染色后拍照，计数直径＞1 mm 的克隆数及克隆形成数目。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。实验重复3次。

6.细胞计数实验（CCK-8）检测A375 细胞增殖能力：将shATAD3A、shCtrl 两组细胞计数后，按照每孔1 000个细胞、100 μl培养基接种于96孔板，置于5% CO2、37 ℃培养箱孵育。每隔12 h 向shATAD3A、shCtrl 组A375 细 胞 孔 中 加 入10 μl CCK-8 试剂。孵育2 h 后在酶标仪上检测波长490 nm处的吸光度，连续测定4 d后行统计分析，以只加CCK-8 试剂的孔吸光度值作为空白孔吸光度值，细胞真实吸光度值（表示细胞增殖活性）=实验孔吸光度值-空白孔吸光度值，吸光度值越大，细胞增殖活性越强。实验重复3次。

7.Transwell侵袭实验检测A375细胞的侵袭能力：将基质胶和培养基按1∶6 比例稀释混合，然后取15 ml 混合液涂抹在Transwell 小室的上室，放入24孔板后置于培养箱15 min 后吸掉上室析出的液体，加 入200 μl 无 血 清 培 养 基 水 化。 对shATAD3A、shCtrl 两组细胞计数后，使用无血清培养基将其重悬，将200 μl含1×104个细胞的悬液加入Transwell小室上室，下室加入含10%血清培养基500 μl，置于培养箱培养24 h。采用多聚甲醛固定，棉签擦拭掉上室细胞，结晶紫染色，在显微镜下（100倍）拍照并计数下室细胞的数目。实验重复3次。

8. 划痕实验检测A375 细胞的迁移能力：将shATAD3A、shCtrl 两组细胞消化计数，按2×105个细胞/孔加入24孔板置于培养箱培养。当细胞生长达90%～100%融合度时，使用10 μl枪头水平垂直划线，用磷酸盐缓冲液反复洗涤以去掉脱落细胞，然后加入无血清培养基继续培养24 h，并在0、6、12、18 和24 h 时测定划痕宽度（0 h 时为“D”，余为“d”），计算划痕愈合率。划痕愈合率=（D-d）/D×100%。实验重复3次。

9.统计学分析：采用SPSS18.0 软件进行统计，Graphpad 6.0 软件作图，结果以±s 显示。两组间实验指标的差异分析采用独立样本t检验，P ＜0.05视为差异有统计学意义。

结 果

一、ATAD3A在黑素瘤组织中的表达

ATAT3A 在黑素瘤组织的表达（0.731±0.115）高于癌旁组织（0.303 ± 0.027），t = 10.825，P ＜0.001，见图1。

图1 Western印迹检测黑素瘤组织（T1、T2、T3）及其癌旁组织（N1、N2、N3）中ATAD3A 的表达 ATAD3A：三磷酸腺苷酶家族蛋白3A；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图2 慢病毒感染A375细胞构建沉默ATAD3A黑素瘤稳定细胞系 2A：慢病毒感染A375 细胞后，荧光显微镜下shATAD3A 组和shCtrl组细胞均显示绿色荧光（比例尺=30 μm）；2B：Western印迹检测两组细胞中ATAD3A的表达。ATAD3A：三磷酸腺苷酶家族蛋白3A；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

二、构建沉默ATAD3A黑素瘤稳定细胞系

慢病毒感染A375 细胞后，荧光显微镜下shATAD3A、shCtrl 两组细胞均显示绿色荧光。shATAD3A 组ATAD3A mRNA 表 达 水 平 为0.230 ±0.073，shCtrl 组为（1.000 ± 0.244），两组比较，t =9.461，P ＜0.001；蛋白表达水平分别为0.866±0.115和0.279±0.267，t=8.595，P=0.002。表明已成功构建敲低ATAD3A的黑素瘤稳定细胞系，见图2。

三、沉默ATAD3A 对A375 细胞克隆形成和增殖能力的影响

shATAD3A 组A375 克隆形成率（22.667% ±2.510%）明显低于shCtrl 组（43.667% ± 5.030%），t=6.464，P=0.003，且形成的克隆体积变小，见图3。CCK-8实验显示，与shCtrl组相比，shATAD3A组黑素瘤细胞增殖活性从第2天开始一直到第4天均明显减弱（第2、2.5、3、3.5、4天t值分别为5.040、4.565、4.785、5.847、10.146，P值＜0.05或＜0.001），见图4。

四、沉默ATAD3A 对A375 细胞侵袭和迁移能力的影响

图3 克隆形成实验检测沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对A375 细胞克隆形成能力的影响 与shCtrl 组相比，shATAD3A 组A375 细胞形成的克隆体积变小，克隆数减少（比例尺=200 μm）

图4 CCK-8 实验检测沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对A375 细胞增殖能力的影响 与shCtrl 组相比，shATAD3A组细胞的增殖活性自第2天开始明显减弱。a：P ＜0.05；b：P ＜0.01；c：P ＜0.001

Transwell 侵袭实验显示，shATAD3A 组A375细胞通过下室细胞数目（68.330±13.050）明显少于shCtrl 组（234.330± 19.139，t = 12.411，P ＜0.001），见图5 。划痕实验显示，与shCtrl 组相比，shATAD3A组细胞从12 h开始迁移速度减慢，划痕愈合率降低（12、18、24 h时t值分别为5.835、6.015、6.574，均P ＜0.01），见图6。

图5 Transwell侵袭实验检测沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对A375 细胞侵袭能力的影响 与shCtrl 组相比，shATAD3A 组A375 细胞通过小室下室的细胞明显减少（比例尺=100 μm）

五、沉默ATAD3A 对A375 细胞自我更新相关蛋白和侵袭迁移相关蛋白的影响

Western 印迹检测显示，与shCtrl 组相比，shATAD3A 组A375 细胞自我更新相关蛋白NANOG（t=5.754，P=0.005）、SOX2（t=6.730，P=0.003）、OCT4（t=11.658，P ＜0.001）和侵袭迁移相关蛋白MMP2（t=17.691，P ＜0.001）、波形蛋白（t=9.537，P=0.002）、SLUG（t=5.242，P=0.006）的表达均显著降低，见图7。

讨 论

图6 划痕实验检测沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对A375 细胞迁移能力的影响 6A：划痕实验代表性图片（比例尺=100 μm）；6B：划痕愈合率统计结果。a：P ＜0.01

图7 Western印迹检测沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）后A375细胞自我更新相关蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵袭、迁移相关蛋白（MMP2、波形蛋白、SLUG）的表达水平 7A、7C：代表性电泳图谱；7B、7D：蛋白相对表达量。a：P ＜0.01；b：P ＜0.001。SOX2：SRY基因相关的HMG 盒2；OCT4：八聚体结合蛋白4；MMP2：基质金属蛋白酶2；SLUG：锌指转录因子；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

ATAD3A 最早是在小鼠肝细胞线粒体膜上被发现，随后证实其定位于线粒体内膜，是一种核编码的线粒体膜蛋白，其基因定位于1号染色体短臂（1p36.33），包含许多与细胞生长有关的调控元件，广泛参与基因的复制、转录、翻译以及胚胎细胞的生长分化等多种生物过程［12-13］。ATAD3A相对分子质量约66 000，锚定于线粒体内膜和外膜的接触位点，包含两个特殊的结构域，即C 端结构域和N 端结构域。C端结构域位于线粒体基质，为ATP酶的核心区域，参与ATP 的合成和水解，并具有与线粒体DNA（mtDNA）结合的接触位点，对维持mtDNA的稳定性至关重要；而N端结构域锚定在线粒体外膜的内表面，含多个跨膜区域，可与内质网膜等相互作用，对维持线粒体结构、功能以及线粒体与内质网之间的相互作用至关重要［2-3］。

ATAD3A先前被发现为c-Myc的靶基因，近年来发现其异常表达与多种疾病的发生有关，在肿瘤的发生进展中扮演重要角色［6］。研究显示，ATAD3A 在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、胶质瘤等肿瘤组织中过表达，与肿瘤分期、组织学分级、生存预后等临床病理特征密切相关，其过表达是肿瘤预后不良的标志之一［7-10，14］。国内学者也发现其高表达于子宫内膜异位组织，与子宫内膜异位组织的种植生长密切相关［15］。但目前尚无关于ATAD3A在黑素瘤中研究的报道。

我们首先采用Western印迹检测ATAD3A在黑素瘤组织中的表达情况，结果提示，相对于正常癌旁组织，ATAD3A 在黑素瘤组织中高表达。这与ATAD3A在其他恶性肿瘤组织中的表达情况一致，提示ATAD3A 可能作为促癌因子在黑素瘤等恶性肿瘤的发生演进中扮演重要角色［7-10，14］。为了进一步研究ATAD3A对黑素瘤恶性表型的影响，本研究采用慢病毒感染方式构建稳定沉默ATAD3A 的黑素瘤A375细胞系，并探讨沉默ATAD3A对A375细胞恶性表型的影响。结果显示，沉默ATAD3A 后，A375 细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显降低，这与既往研究［7，10］结果一致，即沉默ATAD3A 可抑制肺腺癌细胞和乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。Fang 等［7］研究发现，ATAD3A 在细胞周期的S 期及血清饥饿时表达明显增加，提示肿瘤细胞可能通过上调ATAD3A的表达而增加能量供应，从而为肿瘤细胞在乏氧及营养物质缺乏条件下提供可能的存活机制；Teng 等［10］研究发现，ATAD3A 可通过上调Verprolin 同源结构域包含蛋白3 的表达而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，因而沉默ATAD3A 可通过影响上述促瘤环节而影响肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力。此外，ATAD3A 还是蛋白激酶C 的磷酸化结合位点、S100B 的结合蛋白以及哺乳动物西罗莫司靶蛋白、大鼠固醇调节元件结合蛋白1C、细胞周期蛋白Cyclin D1信号通路的调节蛋白，这些信号通路均是影响细胞生长和分化的重要调节位点，因而其功能的异常与细胞生长及分化密切相关［7，12，16］。而ATAD3A是否能通过上述机制影响黑素瘤的增殖、侵袭和迁移能力，还需进一步研究。

NANOG、OCT4、SOX2 是一组多能干细胞转录因子，可促进肿瘤细胞的自我更新能力［17］，且三者均是黑素瘤细胞增殖和成瘤的关键因子，与肿瘤恶性增殖密切相关［18-19］。MMP2、波形蛋白、SLUG 是一组与黑素瘤肿瘤细胞侵袭、转移密切相关的分子，可通过降解细胞外基质、改变肿瘤细胞黏附能力、促进上皮间质转化等多种过程促进黑素瘤细胞的侵袭和迁移［20-23］。本研究结果显示，相比于shCtrl 组，shATAD3A 组 细 胞 中NANOG、OCT4、SOX2、MMP2、波形蛋白、SLUG的表达均明显减弱，说明沉默ATAD3A可抑制A375细胞上述蛋白的表达。提示沉默ATAD3A 可能通过抑制上述蛋白的表达发挥抑制细胞增殖、侵袭和迁移的作用，但其机制仍需进一步深入研究。

先前的研究表明，ATAD3A作为ATP酶及控制线粒体-内质网相互作用的关键分子，在控制一些蛋白和脂质的转运过程中扮演重要角色，其表达异常可导致多种蛋白分子和脂质因子的合成及分泌异常［3］。研究显示，在前列腺癌中ATAD3A可通过α1-抗糜蛋白酶调节线粒体-内质网前列腺特异抗原的分泌而促进前列腺癌的进展［8］。Fang等［7］也发现，血清饥饿时，肺癌细胞中ATAD3A 表达增加的同时，一些转移和血管生成相关基因，如肝细胞生长因子、血管内皮生长因子B及MMP2等的表达也增加。提示ATAD3A 作为线粒体内膜上的功能蛋白，其可影响多种促癌蛋白及因子的合成和分泌，从而在肿瘤的进展中发挥作用。而ATAD3A 是否通过调节线粒体及线粒体-内质网的物质合成及物质交换过程而影响A375 细胞中NANOG、OCT4、SOX2、MMP2、VIMENTIN、SLUG 等表达，还需进一步研究。

本实验显示，ATAD3A 在黑素瘤组织中高表达，沉默ATAD3A可抑制黑素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移能力，ATAD3A可能在黑素瘤的发生发展中发挥重要作用，但尚需进一步探讨ATAD3A在黑素瘤恶性进展中发挥作用的潜在分子机制及临床预后价值。本研究结果为阐明黑素瘤发生演进机制、寻找特异性治疗靶点提供了理论和实验依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突