杨青++张莉++张华山++熊海容

摘要：基于定向改造的木聚糖酶（DSB）和甘露聚糖酶（ManA），通過不同的整合位点和抗性标记实现这两种酶在同一宿主GS115中的整合与筛选，获得了共表达菌株GS115/DSB-ManA。其热稳定性检测结果表明，该共表达菌株产出的DSB与ManA均有较高的热稳定性。重组菌株两种酶的成功表达为复合酶制剂的研究和生产奠定了基础。

关键词：木聚糖酶（DSB）；甘露聚糖酶ManA；毕赤酵母（Pichia pastoris）；共表达

中图分类号：Q19 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）10-1971-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.043

Co-expression of Two Hemicellulases in Pichia pastoris

YANG Qing1，ZHANG Li1，ZHANG Hua-shan2，XIONG Hai-rong1

（1.College of Life Science，South-central University for Nationalities，Wuhan430074，China；2.Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Abstract：Based on the directional modification of xylanase（DSB） and mannan（ManA） synthase genes in our laboratory，the co-expression of these two hemicellulases was successfully achieved in a Pichia cell by different integration sites and resistance markers. And the recombinant strain GS115/DSB-ManA was obtained. The thermal stability test showed that the DSB and ManA produced by the co-expressed strain had high thermal stability. The successful expression of the two enzymes of the recombinant strain laid a foundation for the research and production of the complex enzyme preparation.

Key words：xylanase （DSB）； mannanase （ManA）； Pichia pastoris； co-expression

β-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）和β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）均属于半纤维素酶，分别水解半纤维素中的β-1，4-木糖苷键和β-1，4-甘露糖苷键。木聚糖为半纤维素中最丰富的一类[1]，在木聚糖酶的作用下可被降解为国际市场上急需的低聚木糖和木糖。甘露聚糖作为半纤维素第二大组分[2]，广泛存在于木材以及植物的块茎和种子中。

随着对半纤维素酶的深入研究，其应用领域也在不断的扩展，并拥有一个广泛的工业酶应用市场，包括食品和饲料、咖啡萃取、生物乙醇生产、杀黏菌剂、制药、纺织、洗涤、造纸、石油、天然气工业及生物技术等领域[3，4]。工业生产中，不仅需要高活力的酶，还需要酶在酸性环境、碱性环境或高温条件下保持稳定的酶学特性[5]，同时也希望减低生产成本而提高效益。本试验研究了木聚糖酶与甘露聚糖酶的共表达，实现了这两种酶在毕赤酵母中的稳定共表达，使工业生产中有效地减少生产成本及相关处理环节。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种与质粒 大肠杆菌Top10细胞、表达载体pAO815hr为中南民族大学生命科学学院实验室保藏与构建。毕赤酵母GS115和表达载体pPICZαA为中国农业科学院饲料研究所惠赠。

1.1.2 工具酶及试剂限制性内切酶 T4 DNA连接酶等工具酶和DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；燕麦木聚糖和角豆胶购自Sigma公司；Tryptone、Yeast Extract购自于Oxoid公司；无氨基酵母氮源（YNB）、D-sorbitol、Agar购自Biosharp公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 培养基和抗生素 毕赤酵母抗性选择平板YPDSZ（含终浓度100 μg/mL Zeocin），毕赤酵母组氨酸缺陷型选择平板MD，毕赤酵母生长/诱导培养基BMGY/BMMY，大肠杆菌生长培养基LB/LBL，毕赤酵母生长培养基YPD等培养基配方见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。氨苄青霉素（Ampicillin Sodium Salt）购自Biosharp公司；博来霉素（Zeocin）购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶DSB与甘露聚糖酶ManA重组表达质粒的构建及筛选 采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切木聚糖酶DSB基因和表达载体pAO815hr，连接后转化，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上；同样用EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切甘露聚糖酶ManA基因和表达载体pPICZαA，连接后转化，涂布于含有博来霉素的LB固体平板上。菌落PCR验证后双酶切鉴定筛选出阳性克隆菌株DSB-pAO815hr-Top10和ManA-pPICZαA-Top10。

1.2.2 木聚糖酶与甘露聚糖酶共表达重组菌的构建及筛选

1）GS115/pAO815hr-DSB重组菌的构建及筛选。采用SalⅠ线性化重组质粒DSB-pAO815hr，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，挑取100个该共表达重组菌的单菌落使用BMGY/BMMY诱导产酶，使用DNS法[6]检测酶活力，依据酶活力高低筛选出酶活力较高的重组菌株GS115/pAO815hr-DSB。

2）共表达重组菌GS115/DSB-ManA的构建及筛选。采用SacⅠ线性化重组质粒ManA-pPICZαA，电击转化GS115/pAO815hr-DSB感受态细胞[7]，按上述方法筛选出共表达重组菌株GS115/DSB-ManA。

1.2.3 GS115/DSB-ManA产甘露聚糖酶与木聚糖酶热稳定性的检测 将发酵上清液在不同温度下准确处理30 min，迅速置于冰上冷却，分别在DSB最适温度（75 ℃）与 pH（6.5）下与木聚糖底物反应和在ManA最适温度（75 ℃）与 pH（6.0）下与角豆胶底物反应，使用分光光度计检测OD540 nm，以每种酶最高酶活力为100%，计算各酶在其他温度处理后的相对残余酶活力，每组试验均重复3次，取平均值作为最终结果。

1.2.4 SDS-PAGE电泳 发酵结束后，取GS115/DSB-ManA与两种酶单一表达菌株的上清液进行SDS-PAGE电泳分析，具体操作方法参考《分子克隆实验指南》第二版。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶（DSB）与甘露聚糖酶（ManA）重组表达质粒的构建

将DSB基因片段连接到pAO815hr上，获得表达质粒pAO815hr-DSB；将ManA基因片段连接到pPICZαA上，获得表达质粒pPICZαA-ManA，物理图谱如图1所示，双酶切验证以上重组质粒构建成功。

2.2 热稳定性分析

如图2所示，GS115/DSB-ManA中木聚糖酶在45～70 ℃下处理30 min能够保持85%以上相对酶活力，但经过70 ℃以上温度处理后，相对酶活力降低较为明显；甘露聚糖酶在45～75 ℃下处理30 min后仍能保持90%以上相对酶活力，但经过75 ℃以上温度处理后，相对酶活力降低较为显著。

2.3 SDS-PAGE分析

结果（图3）表明，GS115/DSB-ManA发酵上清液中出现两条电泳条带，分别与单一表达DSB和ManA发酵上清液对比。GS115/DSB-ManA能够同时表达出两种半纤维素酶蛋白，且产物杂、蛋白的分泌量偏低。GS115/DSB-ManA分泌木聚糖酶蛋白较分泌甘露聚糖酶蛋白量高。

3 讨论

目前木聚糖酶与甘露聚糖酶已成功应用于工业农业生产的诸多领域，且通常是木聚糖酶和甘露聚糖酶联合使用从而达到协同增效。pPIC9K和 pPICZαA质粒同属于毕赤酵母分泌型表达质粒，本试验通过不同的整合位点和抗性标记实现了DSB和ManA在同一宿主中的整合与筛选，成功构建了共表达菌株GS115/DSB-ManA，实现了目标酶的共同生产，同时检测出其分泌的两种半纤维素酶有较高的热稳定性，为进一步工业化生产复合酶奠定了基础。

参考文献：

[1] 付 正，张华山，曾小英，等.嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变[J].湖北农业科学，2011，50（7）：1487-1493.

[2] SCHELLER H V，ULVSKOV P. Hemicelluloses[J].Annual Review of Plant Biology，2010，61：263-289.

[3] SITTIKIJYOTHIN W，TORRES D，GON？覶ALVES M P.Modelling the rheological behaviour of galactomannan aqueous solutions[J].Carbohydrate Polymers，2005，59（3）：339-350.

[4] PRAKRAM S C，NEENA P，PRINCE S，et al. Mannanases： Microbial sources， production， properties and potential biotechnological applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology 2012，93：1817-1830.

[5] 張建新，赵丹丹，刘起丽，等.产β-甘露聚糖酶内生菌的筛选及酶学特性分析[J].微生物学通报，2011，38（8）：1172-1178.

[6] 余红英，孙远明，王炜军，等.枯草芽孢杆菌SA-22 β-甘露聚糖酶的纯化及其特性[J].生物工程学报，2003，19（3）：327-331.

[7] WANG Y W，SHI P J，LUO H Y，et al. Over-expression and characterization of an alkali-tolerant endo-β-1，4-mannanase from Penicilliumfreii F63[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，113（6）：710-714.