班晶晶 刘贵珊 何建国 程丽娟 樊奈昀 袁瑞瑞

(宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021)

恩诺沙星[1-乙基-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-1,8萘啶-3-喹啉羧酸，ENO]是一种广谱抗生素类，其化学结构中包含一个萘啶环代替喹啉环。由于具有良好的吸收和较低的不良反应频率[1]，恩诺沙星在家禽养殖业中被广泛用于疾病的预防和治疗，但同时也会造成兽药残留。许多国家规定恩诺沙星的残留量标准为50～500 μg/kg，而中国规定的最高残留量为100 μg/kg[2]。

目前，常见的药物残留量检测方法有酶联免疫检测技术[3]、气相-质谱检测技术[4]和液相-质谱检测技术[5]等。但这些方法的样品处理繁琐、时间长、成本高，难以实现实时快捷的准确定量检测。而表面增强拉曼光谱(SERS)技术具有敏锐、快速、高效的特征，可用于现场实时快速检测。由于SERS的优点，使其在科研工程中备受关注[6-8]。将二维相关光谱法(2D-COS)与SERS结合可应用于乙酸乙酯中氯吡脲的检测[9]、茶叶中残留毒死蜱的拉曼特征波优选[10]、大米中甲基毒死蜱等拉曼光谱的特征优选[11]及中药、油类的参假检测[12-13]等。2D-COS 不仅增强了光谱分辨率，还可凸显重叠峰与弱峰，反映外扰因素的变化。因此，通过设置特定的外扰因素构建2D-COS，可确定与外扰因素最相关的特征峰[14]。

试验拟以鸡肉为研究对象，以自制银溶胶为活性基底，采用SERS技术与2D-COS技术相结合对恩诺沙星进行检测分析，为抗生素残留的快速检测提供新的方法措施，为拉曼光谱在畜禽肉类的质量安全快速检测方面提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

鸡胸肉：市售；

恩诺沙星标准品：上海源野生物科技有限公司；

乙酸乙酯、硝酸银：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

柠檬酸三钠：分析纯，汕头西陇化工股份有限公司；

氯化钠、无水硫酸钠：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；

试验用水为自制超纯水。

1.1.2 仪器与设备

激光拉曼光谱仪：DXR型，美国ThermoFisher公司；

紫外分光光度计：UV1902PC型，上海棱光技术有限公司；

均质机：FA40型，德国弗鲁克公司；

天平：FB224型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 银溶胶的制备 参照文献[15]的方法并修改。将150 mL 0.02%的AgNO3溶液加入至300 mL烧杯中，加热至沸腾，缓慢加入4 mL 1%的柠檬酸三钠至溶液颜色为灰绿色，再继续加热2 min，冷却，备用。

1.2.2 鸡肉提取液的制备

(1) 鸡肉提取液的制备：参照文献[16]的方法并修改。取200 g鸡肉，捣碎成肉糜，于-18 ℃下密封保存。准确称取5 g鸡肉糜和6.0 g无水硫酸钠于50 mL离心管中，加入15 mL乙酸乙酯，均质1 min，6 000 r/min离心10 min，过滤，滤渣重复提取一次，过滤，合并上清液，即鸡肉提取液，0～4 ℃贮藏备用。

(2) 鸡肉提取液加标样本的配制：称取5 mg恩诺沙星标准品，用鸡肉提取液溶于50 mL棕色容量瓶中，超声溶解后定容，得100 mg/L的加标鸡肉提取液样本。再用鸡肉提取液将其稀释成15个浓度梯度，分别用字母B～P表示(0.05，0.10，0.30，0.50，0.70，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，5.10，5.30，5.50，5.70，6.00 mg/L)鸡肉提取液加标样本。

1.2.3 氯化钠溶液的制备 称取0.528 g氯化钠溶于100 mL 超纯水，得0.1 mol/L的氯化钠溶液。

1.3 SERS光谱采集

将400 μL银溶胶、20 μL待测液及100 μL氯化钠溶液依次加入到2 mL按压式带塞离心管中，混匀后进行SERS光谱采集。激光光源波长780 nm，20倍物镜，激光光源功率6 mW，狭缝宽度50 μm，光谱采集范围400～2 800 cm-1。

1.4 二维相关分析

以恩诺沙星浓度为外扰变量进行2D-COS分析，得到二维相关光谱的同步和异步相关谱图。自相关峰表示化学基团对恩诺沙星浓度微扰的敏感程度，以同步二维相关谱图中的等高线反映其相关峰的强弱，峰强度越高，表明该谱峰对外扰浓度越敏感[17]。

1.5 光谱预处理

采用标准正态化(SNV)对原始反射光谱进行预处理，采用竞争性正自适应加权算法(CARS)对预处理后的光谱进行调整提取并建立预处理后光谱的偏最小二乘(PLSR)模型。

1.6 数据处理

使用Unscrambler X 10.4软件进行预处理和建立模型；使用Matlab 2014a提取特征波长；使用Origin 8.0软件进行数据绘图。

2 结果与讨论

2.1 鸡肉提取液加标样本的SERS及2D-COS分析

由图1、2可知，恩诺沙星的拉曼峰为732，1 320，1 437，1 531，1 624 cm-1；732，921，1 080，1 320，1 437，1 531，1 624 cm-1处有较强的拉曼峰。随着鸡肉提取液加标样本浓度的变化，732，1 437 cm-1处峰值有明显变化。732 cm-1处峰是由于亚甲基的摇摆，1 320 cm-1处峰是由于对称的O—C—O拉伸振动，1 437 cm-1处峰是由于苯环的振动，1 531 cm-1处峰是由于苯环的伸缩，1 624 cm-1处峰是由于C—O伸缩振动[18]。

图1 恩诺沙星标准品的拉曼光谱

图2 鸡肉提取液加标样本的表面增强拉曼光谱图

图3 拉曼二维相关同步谱图

图4 拉曼二维相关异步谱图

2.2 基于二维相关光谱优选变量的PLSR模型建立

由表1可知，CARS方法的Rc、Rp分别为0.718 2，0.876 7；2D-COS方法的Rc、Rp分别为0.979 7，0.997 2。结果表明，利用2D-COS方法优选出的5个恩诺沙星特征谱峰所建立的PLSR模型性能优于CARS方法的，说明利用2D-COS方法优选的特征波建立的模型可用于鸡肉中恩诺沙星残留的实际估测。

表1 基于特征波段的PLSR建模效果

3 结论

使用SERS技术结合2D-COS方法对鸡肉中的恩诺沙星残留进行检测。结果表明，利用2D-COS方法筛选出的5个与恩诺沙星浓度变化相关的特征峰(732，1 320，1 437，1 531，1 624 cm-1)与分析光谱信息得到的吸收峰吻合。相比于CARS提取特征波方法，2D-COS方法更能使得大量而又复杂的光谱信息简单化且能优选出与恩诺沙星密切相关的特征峰，使复杂的拉曼光谱分析更加简单、可靠。SERS与2D-COS结合能对恩诺沙星进行有效的特征波长优选，可应用于鸡肉中抗生素的检测。试验发现SERS信号受活性基底影响较大，自制胶体稳定性还有待提高。后续可以考虑在养殖过程中对肉鸡进行注射或饲料添加等方法，实现抗生素的均匀添加，再对鸡肉进行检测，使该检测方法得到有效的推广和普及。