谢安国 王满生 石晓微 王飞翔 康怀彬

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 4710003； 2. 中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205)

通常食物中的水分有结合水、半结合水和游离水等不同状态。水分含量及其分布状态对食品品质有重要影响[1]，具体在肉制品中，水分状态可能会影响滴水损失、色泽、嫩度等食用品质，进而影响消费者的购买和食用欲望[2]。因此在肉制品加工过程中，深入研究其水分含量与状态变迁具有重要意义[3]。

目前，针对肉及肉制品水分含量大多采用国标烘干法进行测定，但这种方法并不能准确表达不同状态水的分布状况及定量分析。低场核磁共振(Low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)是指1H、13C、129Xe等原子核在恒定磁场和交变磁场的作用下发生共振吸收与发射过程，其中恒定磁场强度低于0.5 T。LF-NMR技术测试速度快、精确度高、对样品无损耗，近年来逐渐被用于食品、纺织、建筑等多领域研究[3-4]。在食品加工方面，刘丽美等[5]基于LF-NMR技术探讨了不同油炸温度对牛肉干水分分布与品质的影响，苗颖等[6]考察了不同热烫温度对纤丝干酪水分状态的影响，姜秀丽等[7]研究了不同烘干温度对牛肉干品质及水分分布的影响，这些研究结果均表明，温度对水分分布有显著影响，且低场核磁能够清晰、准确地展示3种状态水的分布情况。

但是在肉熟化过程中水分分布研究方面，大多数研究样本数目较少，时间间隔较大，水分的动态变迁不够清晰。另外，很多文献[5,7]中只选取了低场核磁的峰面积比进行了分析，只关注峰面积比所代表3种状态水的分布情况，而信号峰的峰高、峰宽、峰位置等诸多参数被忽视，肉品熟化过程中，这些峰参数如何变化，它们与肉品品质存在什么潜在关系等相关研究未见报道。基于此，研究拟在牛肉水煮受热6 min内进行高密度采样，对牛肉低场核磁信号峰进行全参数和动态连续分析，并研究核磁信号峰与肉品品质之间的相关性，同时基于核磁信号参数模拟分析肉品受热过程中水分、嫩度和色差的变化规律，为完善低场核磁共振分析方法和挖掘潜在信息价值提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛背最长肌肉(Longissimus dorsi，LD)：市售。

1.2 仪器与设备

电子分析天平：JA5003B型，上海精科仪器有限公司；

鼓风干燥箱：DHG9425A型，上海恒科学仪器公司；

电热恒温水浴锅：HH-S4型，北京科伟永兴仪器有限公司；

色差计：Xrite Color i5型，美国Xrite公司；

数显式肌肉嫩度仪：LM3B型，东北农业大学工程学院；

低场核磁共振成像分析仪：MINI20-015V-I型，上海纽迈电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 整体试验过程 将牛肉里脊去除脂肪和结缔组织，分割为4 cm×4 cm×2 cm的牛肉块，装入编号的蒸煮袋中并置于水浴锅中蒸煮(99 ℃)。在受热过程中进行高密度采样，由于肉品受热初期物质结构变化剧烈而后期变化缓慢，因此采样采取前期密集后期较稀疏的模式。具体试验流程如图1所示，1号样品受热0 s(鲜肉)，2号样品受热1 s，以此类推，第45号样品受热360 s，每个处理重复3次。最后对处理过的样品分别进行LF-NMR驰豫特征分析和肉品品质评价。

图1 试验流程图

1.3.2 牛肉低场核磁信号峰测定与分析 准确称量相同质量(0.6 g)的牛肉条放入直径为15 mm的玻璃管中，然后置于LF-NMR仪的磁体永久磁场中心位置，利用软件分析自由感应衰减(free induction decay，FID)脉冲序列矫正系统参数，再利用自旋回波(carr-purcell-meiboom-gill，CPMG)脉冲序列采集样品横向弛豫时间(T2)，数据反演的迭代次数设为10万次得到T2反演谱[3]，重复测定3次。

在核磁共振现象中，原子核从高能状态恢复到低能状态的现象称为弛豫过程，包括纵向弛豫T1和横向弛豫T2。弛豫时间是解析物质化学结构的重要参数[8]，T1是旋转核与周围环境之间进行能量交换，T2则是在自旋系统内部发生的交换能量[9]。对于生物材料，T2对多相态的存在更敏感，变化范围较大。因此利用LF-NMR分析技术，基于横向弛豫时间(T2)来研究牛肉中的水分特征。

通常食品研究中，只需提取LF-NMR的峰面积，计算其对应3种状态水的变化[10-11]。试验将提取和分析核磁信号峰的所有参数信息，包括峰面积(A)、峰面积比(AR)、峰高(H)、峰宽(W)和峰位置(P)。峰位置即波峰最大值对应的驰豫时间。

1.3.3 牛肉理化指标的测定

(1) 含水率：按GB 5009.3—2016的直接干燥法(105 ℃)执行。

(2) 蒸煮失水率：根据文献[12]。

(3) 肉品色差：用色差计测定[8]。

(4) 肉品剪切力：按NY/T 1180—2006执行。

1.3.4 数据统计分析 利用SPSS软件完成数据统计与Pearson相关性分析，利用Origin 2017进行作图。利用MATLAB2014a软件编写逐步回归算法，对加热过程中肉品建立数学模型，并模拟水分、色泽等指标动态变化。

2 结果与分析

2.1 核磁信号峰参数在加热过程中的变化规律

通过LF-NMR的横向弛豫时间(T2)分析了牛肉加热过程中3种组分水的变化。横向弛豫时间T2能反映样品内部质子所受束缚力与自由度的大小，T2越大，水分的自由度越高。依照驰豫时间T21(<10 ms)、T22(10～100 ms)、T23(>1 000 ms)可以将牛肉中水分划分为结合水、半结合水和自由水3种状态[2,5]。

2.1.1 峰面积和峰面积比的变化 由图2可知，随着加热时间的延长，峰面积A23显著增加；A21峰、A22峰面积和峰总面积均没有显著变化。由图3可知，T21峰缓慢减少，T22显著减少，鲜肉中不存在T23峰，但受热10 s后，T23峰面积占比显著增加。T21是存在于细胞内与大分子物质和水合离子紧密结合的水，结构较稳定，因此加热中T21变化较小。而T22被认为是半结合水，分布在肌原纤维内部，在肉品熟化过程中一部分不易流动水转变成了自由水[12]，导致自由水含量增加。这部分水排出到肌原纤维网络外，因此代表自由水的T23峰在受热一段后出现，且比例增加。通过理化分析可知，受热后肉品中总水分减小，但在熟化过程中总的峰面积变化不大。因此，低场核磁的峰面积数值并不能直接反映肉品中水分含量。此外，加热中T21峰、T22峰及峰总面积变化不显著，折算成3个峰的面积比后数值的变化规律显著(P<0.01)。因此，面积比更能反映食品中水分结构变化。

图2 热处理过程中牛肉低场核磁峰面积的变化

图3 热处理过程中牛肉低场核磁峰面积比的变化

2.1.2 峰高和峰宽的变化 肉品熟化过程中，核磁波峰形状的变化大于峰面积的变化。对于T21峰，峰高和峰宽平均值未发生明显变化(见图4、5)，但峰宽的数值波动(方差)随加热时间的增加显著增大。T21峰结合水是与食品成分中蛋白质、黏多糖、磷脂及盐类坚固结合，受到束缚的水；在肉品中主要是与肽链的羧基和氨基等离子基团牢固结合。肉品受热熟化时，结合水数量比例没有发生显著变化，但是水与蛋白质结合的不稳定性增加，因此数值方差增大。

图4 热处理过程中牛肉低场核磁峰高的变化

信号峰形状变化最为明显的是T22峰，峰宽度显著增加且高度显著降低(P<0.01)，说明数据集中度下降、多样性增加。牛肉加热中蛋白质结构会发生较明显变化[13]，蛋白质离子键和氢键含量呈不断下降的趋势，疏水相互作用和二硫键含量显著升高。热处理过程中，肌原纤维蛋白的二级结构发生重排[14]，蛋白质分子中N—H和C—N伸缩振动以及N—H弯曲振动比较活跃[15]；芳香族氨基酸残基越来越多的暴露在蛋白分子的表面。前期研究结合核磁T22峰形状特征可推断：自然状态下蛋白质分子会折叠成有序的三维结构[16]，疏水基团在内部，亲水基团在蛋白表面。水分子围绕蛋白质形成的亲水层，水—氨基酸结合的氢键类型比较集中，因此核磁峰的宽度较窄、数据集中。当蛋白受热变性后，形成大量无序卷曲，大量疏水键暴露，导致蛋白质的三级结构发生了变化。蛋白质肽链与水分子形成氢键的类型增加，氢原子间距会发生相应变化。因此核磁峰的宽度增加、多样性增加。

图5 热处理过程中牛肉低场核磁峰宽的变化

T23峰加热约25 s后出峰，宽度增加到一定数值后稳定；高度会随熟化程度缓慢增加。说明蛋白质变性后，半结合水转化为自由水后，自由水类型没有发生明显变化，而自由水数量的增加主要反映在信号峰的高度上。

2.1.3 峰位置的变化 由图6可知，T21峰左移，方差增大，T22峰缓慢左移，T23峰出峰后显著左移。结合水被认为是围绕肌肉固形物强极性基团形成一个单分子层的水，半结合水是亲水基团周围的多层水及邻近水。蛋白质变性后，特定空间结构被破坏[12,17]，部分区域变成无序的线状结构。围绕在肽链周围的单层水和多层水形状也会发生变化。因而蛋白质与水分子的间距平均值缩短，可能是3个核磁峰左移、驰豫时间都缩短的原因。

图6 热处理过程中牛肉低场核磁峰位置的变化

2.2 核磁峰与肉品品质的相关性分析

由表1可知，熟化过程中随着熟化时间的增加蛋白质产生变性并伴随着脂肪氧化，使肉品颜色发生改变，总体表现为亮度(L*)增加、红度(a*)降低和黄度(b*)增加，这是由于随着加热时间的增加，肉品中的肌红蛋白产生变性导致肌红蛋白数量减少，所以肉品的表面颜色从鲜红变为白色，同时伴随着脂肪氧化程度的增加，使肉品颜色的黄度(b*)增加。剪切力是模拟人咀嚼时咬断肌纤维所需的力量，牛肉受热熟化的过程中剪切力值发生显著变化(P<0.01)，呈先升高后降低的趋势。加热初期，蛋白质受热变性形成凝胶，肌纤维收缩脱水，肌原纤维蛋白和结缔组织蛋白的张力增加，剪切力逐渐增大肉品组织变硬。而后剪切力快速下降，可能是由于持续加热使得蛋白质持续降解，肌纤维变得松散甚至断裂[18]。蛋白质降解加剧，肌纤维受热冲击严重，导致剪切力值下降。

NMR技术通过对样品中含氢流体的监测，实现在无损条件下观察样品中含氢流体的分布和变化规律。虽然NMR信号主要反映食品水分的变化，但水分作为肌肉中的最主要成分，通过微观结构上的变化，可能对肉品色泽、嫩度、风味、多汁性等多项口感品质存在潜在影响。表1中分析了核磁信号峰各参数与肉品品质指标之间的相关关系，结果表明两者的确存在许多显著相关。肉品含水量、蒸煮损失率与12个峰参数中的9个呈极显著相关，尤其是峰高、峰宽和峰位置与品质指标的相关性均大于峰面积比。剪切力与T22峰的峰高、峰宽，以及T23峰位置极显著相关，可能是细胞胶态原生质受热后结构被破坏，组织细胞的硬度和弹性发生改变[19]。Lab色泽系统中，b*值与核磁参数的相关性最大，L*值其次，a*值最小。肌红蛋白的化学状态决定了肌肉的颜色变化，说明这些信息可以反映在核磁峰信号上。

表1 LF-NMR峰参数与牛肉品质指标的相关性分析†

2.3 基于核磁信号峰参数建立对肉品理化指标的回归模型

核磁信号与肉品品质之间存在大量潜在相关，因此试验基于核磁信号参数对肉品理化指标建立回归模型。选择逐步回归法对多个变量进行分析。逐步回归的基本思想逐个剔除影响不显著的变量，保留影响显著的变量，最终使得回归方程拟合趋于稳定合理。回归计算在MATLAB中进行，核心代码：stepwize(X,Y)。如表2所示，基于核磁参数对肉品品质的数学模拟，含水量和蒸煮损失模拟效果最好，其次为色差L*和b*值，对a*值和剪切力模拟能力稍弱。通过剔除影响不显著的峰参数，可知含水量和蒸煮损失受峰面积比和峰位置影响较大；色差L*和b*值主要受到峰高、峰宽和峰位置影响；剪切力受峰面积比和峰形状参数的多重影响。

表2 基于LF-NMR峰参数对牛肉品质指标的数学模拟

3 结论

对牛肉加热过程中的45个时间点进行了高密度采样，分析了信号峰的全部参数及肉品品质变化，且所得实验数据平滑合理，变化规律清晰。结果表明随着加热时间的增加，代表半结合的峰面积比下降，自由水的峰面积比增加。在峰形状特征上，T22峰宽度增加、高度下降；T21峰宽度的数据波动增大；3个峰峰位置都显著左移。研究还发现，当牛肉蛋白受热变性后三级结构发生变化，大量无序卷曲形成和大量疏水键暴露，导致肽链与水分子形成氢键的类型增加，氢键间距变化，使得相对应的核磁峰宽度增加、多样性增加。

此外，核磁峰参数与肉品多个品质指标之间存在极显著相关，并且峰高、峰宽和峰位置与品质指标的相关性大于峰面积比。通过核磁信号峰参数建立的数学模型在含水量、蒸煮损失、色差L*值、a*值、b*值和剪切力等指标上模拟效果理想，模拟值与实测值相关系数R2分别达到了0.943，0.936，0.791，0.717，0.876，0.694。因此，研究结果充分证实了，在食品核磁信号分析中，峰高、峰宽和峰位置等形状特征参数所含的信息价值不低于峰面积，且为完善LF-NMR分析方法和挖掘潜在信息价值提供了一定的参考。