张 瑶 吴龙国 马桂娟 龚 慧 高 琳 孙 谦

(1. 宁夏食品检测研究院，宁夏 银川 750021；2. 宁夏大学，宁夏 银川 750021； 3. 岛津企业管理〔中国〕有限公司，陕西 西安 710032)

蔬菜作为人们日常饮食中不可或缺的食物之一，主要为机体提供所需的维生素、矿物质、纤维等营养物质，以满足机体正常的新陈代谢。而在蔬菜种植过程中会发生各种各样的病虫害，种植者常常会使用农药杀菌剂进行防治，避免蔬菜进一步受到病虫害的侵染，这就很容易造成杀菌剂在蔬菜中的残留问题，对人体身体健康存在潜在的危害。

目前，中国蔬菜作物上登记的杀菌剂成分150种，不同成分登记的杀菌剂产品达220种[1]。最新发布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》，新增了51种农药、2 967项农药最大残留量限量标准[2]。中国学者针对杀菌剂在水果[3-7]、蔬菜[8-13]以及土壤[14-15]中的残留做了大量的研究，结果表明在农产品中杀菌剂残留检出率较高，尤其番茄和黄瓜中常见的啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯10种杀菌剂残留尤为突出。

随着现代分析化学技术的提高，农药残留检测也有了迅速的发展，农药残留检测主要采用气相色谱串联质谱法[16-17]、液相色谱—串联质谱法[18-20]等。液相色谱法和气相色谱质谱联用法容易受到基质的干扰，耗时耗力、检测效率低，不能满足目前杀菌剂种类不断增加、分析通量相应提高的需求。由于固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)通过选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，可同时完成样品富集与净化，大大提高了检测灵敏度。因此，试验拟采用气相色谱—串联质谱法结合固相萃取技术对番茄和黄瓜中杀菌剂残留的检测进行研究，旨在为监测其他蔬菜中的农药残留提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯标准品：纯度>99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

甲苯、丙酮、环己烷、正己烷、乙酸乙酯：色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；

氯化钠：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)：色谱纯，美国安捷伦公司。

1.1.2 主要仪器设备

三重四极杆气相色谱质谱联用仪：GCMS-TQ 8040型，岛津企业管理(中国)有限公司；

数显型分散机：IKAT25型，德国IKA公司；

旋转蒸发仪：BUCHI V-850型，瑞士步琦实验室公司；

全自动凝胶净化系统：GPC1000型，北京莱伯泰科仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 将啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯的标准品用甲苯配制成1.0 mg/mL的杀菌剂标准溶液。再根据试验所需配置成一定浓度的标准溶液。

1.2.2 样品前处理 分别称取15.00 g制备好的番茄和黄瓜蔬菜混匀的试样于50 mL塑料离心管中，加入5 g氯化钠，加入15 mL乙腈溶液，先10 000 r/min高速匀浆2 min，再以4 000 r/min离心6 min，转移上清液于梨形瓶中，加入30 mL乙腈，重复提取1次，合并2次上清液，40 ℃浓缩至近干，用2 mL环己烷—乙酸乙酯溶解鸡心瓶中残留物。

1.2.3 SPE净化 将1.2.2中溶解液过固相萃取柱，以乙酸乙酯/环己烷为洗脱液，收集洗脱液，40 ℃旋蒸，用2 mL 乙酸乙酯/环己烷定容，加入PSA，混匀，0.22 μm滤膜过滤，供GC-MS/MS测定。

1.2.4 GPC净化 将1.2.2中溶解液置于GPC样品瓶中，采用GPC进行净化，环己烷乙酸乙酯作为流动相，设置参数：进样体积2 mL，流速4 mL/min，在波长254 nm下进行检测。在第11～19 min内收集洗脱液至鸡心瓶中，40 ℃旋蒸，用2 mL乙酸乙酯/环己烷定容，加入PSA，混匀，0.22 μm滤膜过滤，供GC-MS/MS测定。

1.3 仪器条件

色谱柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱温程序：初设温度160 ℃，保持1 min；以15 ℃/min升至280 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min升温至300 ℃，保持10 min。流速：1.4 mL/min；进样量：1 μL；进样方式：不分流进样；载气：氦气，纯度≥99.999%；进样口温度：300 ℃；流速控制方式：恒线速度方式；柱流量：1.2 mL/min；进样方式：不分流进样；高压进样：250 kPa(1 min)；离子化方式：EI；离子源温度：230 ℃；色谱质谱接口温度：280 ℃；检测器电压：调谐电压+0.6 kV；采集模式：MRM；啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯的离子对及保留时间信息见表1。

1. 啶氧菌酯 2. E-苯氧菌酯 3. 醚菌酯 4. 嘧螨酯 5. 肟菌酯 6. 醚菌胺 7. 肟醚菌酯 8. 氟嘧菌酯 9. 吡唑醚菌酯 10. 嘧菌酯

表1 化合物名称、保留时间及选择离子

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

在SCAN扫描模式下，将10种杀菌剂(啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯)目标化合物进行全扫描，获得各个物质的保留时间以及质荷比较大、丰度较高的特征性一级碎片离子。利用EI源采用不同能量值轰击母离子，得到不同能量下的二级质谱图。选择丰度较高、质荷比较大、特征性强的离子以确定最优的碰撞能量，在此能量值合适范围内做进一步优化，获取最佳碰撞能量，得到100 μg/L质量浓度的10种杀菌剂标准溶液色谱图，如图1所示。

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取试剂的选择 因啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯10种杀菌剂属于不同结构的化合物，但易溶于甲苯、乙腈等有机试剂，而且以乙腈作为提取溶剂，可以减少杂质干扰，同时沉淀蛋白质，使提取率更高，提高待测组分的回收率。

相比采用乙酸乙酯/正己烷(1∶1)，正己烷/丙酮(4∶6)，采用乙腈作为提取试剂对 10种杀菌剂的回收率范围较合适，主要是因为乙酸乙酯/正己烷(1∶1)与正己烷/丙酮(4∶6)作提取剂时，提取的色素等杂质较多，不宜净化，对待测目标物的干扰较大。

2.2.2 提取方式的选择 对比了匀浆、超声、振荡3种提取方式：均质提取2 min、超声提取20 min和震荡提取30 min。经试验证明，超声和振荡对样品的粉碎程度要求较高，且回收率偏低。匀浆提取，花费时间较短，样品均匀分散，且经过两次反复提取，回收率较高。

2.2.3 净化方式的选择 对比分析了石墨氨基柱、GPC以及氨基柱的固相萃取净化方式对除去色素干扰的效果。试验结果表明：10种甲氧基丙烯酸酯类化合物经石墨氨基柱净化后，除氟嘧菌酯回收率低于30%，剩余物质均介于83.6%～117.9%，主要是源于石墨化炭黑对平面结构的农药有一定的吸附作用。氟嘧菌酯分子结构中含氯苯氧基和苯基以及六元杂环，容易被吸附，因此，难以从石墨氨基净化柱上洗脱。采用GPC净化时，由于不同基质对吸收波长下样品接收存在不同程度的干扰，容易造成回收率偏高，且对试剂的消耗量较大，虽净化效果较好，但不适合大批量、多种复杂基质的检测。而采用氨基柱，10种物质在番茄中的回收率范围均为84.7%～117.0%，回收范围较好，且方便快捷，可应用于不同基质的大批量样品的同时检测分析。因此，最终选择氨基柱进行净化。

2.2.4 基质效应 由于基质效应的存在，容易得到假阳性或假阴性的错误检测结果，并对待测样的准确定量造成严重干扰[15]。为了避免基质效应的影响，同时提高待测样品的检测准确度，采用不含杀菌剂的提取液作为空白基质，绘制标准曲线，从而降低基质对测定结果的影响。为了对比不同杀菌剂的基质效应，按式(1)求得10种杀菌剂的基质效应。10种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在番茄和黄瓜中的基质效应如图2所示。

图2 10种杀菌剂在黄瓜和番茄中的基质效应

ME=Km/Ks，

(1)

式中：

ME——基质效应；

Km——基质标准曲线的斜率；

Ks——溶剂标准曲线的斜率。

2.2.5 标准曲线、线性范围及检出限 为降低基质中的干扰物质对目标化合物产生基质效应，分别提取了不含杀菌剂的番茄与黄瓜提取液作为空白基质液。用空白基质提取液将混合标准溶液稀释成相应浓度的标准曲线，然后进行测定。10种杀菌剂的线性回归方程、相关系数、线性范围及检出限(信噪比S/N≥3)见表2。结果表明，10种杀菌剂在基质中相关系数均达到0.999 1以上。

表2 相关系数及灵敏度测试结果

2.3 回收率和重现性

通过回收试验，测定方法的准确度和精密度(n=6)，

添加回收率试验结果见表3。取不含待测成分的空白样品在0.05，0.01 mg/kg的浓度水平上进行加标回收试验，每个水平重复6次，按照试验方法对样品进行提取、净化，测得番茄、黄瓜中的加标回收率及相对标准偏差(RSD)如表3所示。

表3 番茄和黄瓜中10种杀菌剂的平均回收率和相对标准偏差

2.4 实际样品的检测

随机抽取检测市场上购买的蔬菜样品19份，其中嘧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌酯、肟菌酯、啶氧菌酯的检出率分别是28.1%，15.6%，12.5%，6.2%，3.1%，其余均为未检出。

3 结论

试验采用气相色谱—串联质谱结合固相萃取技术，对蔬菜中啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯10种杀菌剂残留进行了测定。结果显示，10种杀菌剂药在1.0～200.0 μg/L的质量浓度范围内，具有良好的线性关系，相关系数均>0.999 1，方法检出限为0.1～0.5 μg/kg。实际样品加标回收率为84.7%～117.0%，相对标准偏差(n=6)为0.4%～4.7%。结果表明，采用高效气相色谱—串联质谱法结合固相萃取技术的试验方法净化效果较好，稳定准确，灵敏度高。后续将扩大检测样品的类型和数量，不断去验证该方法的稳定性。