王 玮，靳贺超，耿秀超，于文涛,3△，王香婷△，李青敏，董文军

(1. 北京市海淀区双榆树社区卫生服务中心，北京 100086； 2. 河北中医学院，石家庄 050200；3. 河北省心脑血管病中医药防治重点实验室，石家庄 050091)

建立合理、科学的动物模型是深入开展实验研究的基础，对探讨疾病的发病机制、评估药物干预疗效具有重要意义。肾虚血瘀证是血管性痴呆(VD)患者常见的证候类型[1]，但目前尚缺乏理想的血管性痴呆肾虚血瘀证病证结合动物模型。本研究采用高龄大鼠双侧颈总动脉永久性结扎法，试图建立肾虚血瘀证VD病证结合动物模型，通过观察动物表征及病理组织学、血清学等相关指标的变化，对该模型进行评价。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，其中40周龄30只(合格证号11400700220320)，体质量(619±40) g，使用前饲养至52周龄；8周龄30只(合格证号11400700221664)，体质量(263±7) g；SPF级雌性SD大鼠8周龄40只(合格证号11400700223106)，体质量(264±8) g，实验动物均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(动物许可证号SCXK(京)2016-0011)。本实验已通过河北中医学院实验动物伦理委员会审查。

1.2 主要试剂

一氧化氮(NO)测试盒(南京建成生物研究所,货号A012-1)；内皮素(ET-1)试剂盒(北京北方生物技术所,货号D11PZA)；雌二醇(E2)放射免疫分析药盒(天津九鼎医学生物公司,货号RG61706)；睾酮(T)放射免疫分析试剂盒(天津九鼎医学生物公司,货号RG41706)；骨钙素(BGP)放射免疫分析试剂盒(北方生物技术研究所,货号 G02PZA)；钙(Ca)检测试剂盒(南京建成生物研究所,货号 C004-2)；磷(P)试剂盒(长春汇力生物技术公司,货号 B008)。

1.3 主要仪器

ZS-001型Moriss水迷宫,北京众实迪创科技公司；HM-200型电子天平，日本AND公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；LBY-N7500B型全自动血流变仪，北京普利生仪器有限公司；DP73型数码显微镜，日本Olympus 公司。

2 方法

2.1 动物分组

SD雄性52周龄大鼠随机分为高龄模型组和高龄假手术组各8只；SD雄性8周龄大鼠随机分为低龄模型组和低龄假手术组8只。造模过程中及造模后死亡大鼠及时补充，使各组大鼠数目维持在8只。

2.2 模型建立

低龄模型组和高龄模型组采用双侧颈总动脉永久性结扎法造模[2]。大鼠术前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛溶液按400 mg/kg体质量腹腔注射麻醉，待翻正反射消失后仰卧位固定于手术台，颈前手术区域备皮、酒精消毒，行颈前正中切口，钝性分离皮下结缔组织及颈前肌群，避开迷走神经分离双侧颈总动脉，用手术丝线结扎，逐层缝合皮肤，术后连续3 d肌注硫酸庆大霉素。低龄假手术组与高龄假手术组行颈前切口，分离双侧颈总动脉不予结扎。

2.3 大鼠表征观察

各组大鼠常规饲养，充足食水，每日观察并记录大鼠精神活动(喜动喜静，活动灵活度，反应灵敏度，应激能力，攻击行为，是否喜扎堆等)、体态(是否缩肩拱背、眯眼等)、皮毛(光泽度，有无竖毛、枯疏、晦暗)、舌质；尾色(颜色，有无褐斑)、采食量及饮水量、大便(正常/稀溏/干燥)和体质量变化等情况。

2.4 雌鼠受孕数、产仔数观察

术后3周每组大鼠随机抽取5只雄鼠。每只雄鼠配2只8周龄雌鼠，每晚18∶00合笼喂养，第2天早晨8∶00观察雌鼠阴栓，将发现阴道栓之日确定为妊娠第 1 天，并取出雌鼠单笼喂养，连续观察1周，统计受孕雌鼠数目及每只雌鼠产仔数。

2.5 水迷宫行为学检测

术后4周进行Morris水迷宫实验。测试时间为6 d，1～5 d进行定位航行试验，将大鼠从东西南北4 个象限放入水中，分析系统自动记录2 min内大鼠找到平台位置时间，即逃避潜伏期。第6天进行空间探索实验，移除实验平台将大鼠放入水中任选一入水点，记录大鼠2 min内跨越原平台的次数及停留时间，以测试大鼠空间探索能力。

2.6 雄鼠睾丸重量指数检测

水迷宫结束后各组大鼠麻醉，下腹部行V字型切口暴露腹腔，找出睾丸组织剥离输精管及附睾，剪下左侧睾丸称重，按公式[睾丸指数=睾丸湿重(g)/大鼠体质量(kg)]计算睾丸指数。

2.7 海马病理形态观察

各组大鼠断头取血10 ml，用于血清学指标检测。冰盘上迅速剥离出脑组织，4%多聚甲醛中固定，乙醇逐级脱水，浸腊包埋、切片，尼氏染色，于光学显微镜下观察脑海马病理形态变化。

2.8 血液流变学检测

取血2 ml肝素钠抗凝，用全自动血流变仪测定全血还原黏度(低、中、高切)、血浆还原黏度(低、中、高切)和聚集指数等指标。

2.9 血清NO、ET-1、T、E2、Ca、P、BGP水平检测

取血5 ml分离血清，采用硝酸还原酶法检测NO水平，采用放免法检测ET-1、T、E2、BGP水平，采用化学法检测Ca水平，采用紫外比色法检测P水平。

2.10 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠表征变化

图1示，低龄假手术组大鼠喜动，反应灵活，体毛有光泽，无眯眼，抗激能力强，舌质鲜红润泽、较短，采食量及饮水量正常，大便正常;低龄模型组大鼠活动不灵活，反应迟钝，体毛不光泽，单侧眯眼，弓背，尾巴有黄褐色斑，舌质暗红，饮食量减少，体质量增加缓慢，大便或干或稀有恶臭；高龄假手术组大鼠喜静，反应迟缓，攻击行为减少，喜扎堆，体毛发黄晦暗无光泽，无眯眼，抗激能力弱，尾巴黄褐色斑颜色较低龄假手术组加深，舌质暗红，舌根处明显，饮食量及饮水量减少，大便干燥；高龄模型组大鼠眯眼，自主活动减少，喜卧，行动迟缓，反应迟钝，攻击性行为减少，腰背蜷缩，喜扎堆，体毛枯疏、晦暗或发黄无光泽，尾巴有不同程度紫或黄褐色的斑，舌质紫暗，饮食量减少，体质量增加缓慢，半数以上大鼠粪便干燥，少数大鼠呈稀便且有恶臭。

图1 各组大鼠表征变化比较

3.2 空间记忆学习能力变化

表1示，与低龄假手术组比较，低龄模型组大鼠与高龄模型组逃避潜伏期延长，穿越原平台次数及在原平台停留时间均显著缩短(P<0.05或P<0.01)，高龄假手术组大鼠穿越原平台次数及在原平台停留时间均减少(P<0.05)；与高龄假手术组比较，高龄模型组逃避潜伏期显著延长，穿越原平台次数及在原平台停留时间显著缩短(P<0.01)；与低龄模型组比较，高龄模型组逃避潜伏期显著延长，穿越原平台次数及在原平台停留时间显著缩短(P<0.05或P<0.01)。

表1 各组大鼠水迷宫学习记忆能力比较

3.3 生殖功能变化

表2示，与低龄假手术组比较，低龄模型组产仔数显著降低(P<0.01)，高龄假手术组睾丸指数和产仔数显著降低(P<0.01)，高龄模型组受孕雌鼠数、睾丸指数和产仔数显著降低(P<0.05或P<0.01)；与低龄模型组比较，高龄模型组睾丸指数和产仔数均显著降低(P<0.01)。

表2 各组大鼠生殖功能比较

3.4 脑海马病理形态观察

图2示，低龄假手术组大鼠海马CA1区可见，椎体细胞排列致密，层次分明有序，细胞形状规则，细胞核圆而大，核仁清晰，胞浆内Nissl小体体积大，数量多，神经纤维密集，排列整齐，深染；低龄模型组大鼠海马CA1区可见椎体细胞层次减少，排列无序，细胞间隙增大，部分脱失，胞浆内Nissl小体数量显著减少，细胞核体积变小，结构不清，呈核固缩表现，形状不规则，染色变浅，神经纤维排列杂乱；高龄假手术组大鼠海马CA1区可见椎体细胞较低龄假手术组数量减少，细胞间隙增大，胞浆内Nissl小体数量明显减少，神经纤维排列较整齐，部分细胞核有固缩现象；高龄假手术组大鼠海马CA1区可见椎体细胞减少甚至消失，排列稀疏，明显脱失，胞浆内Nissl小体消失，神经纤维紊乱排列，细胞核缩小，形状呈三角或多角形。

3.5 血液流变学指标变化

表3示，与低龄假手术组比较，低龄模型组与高龄模型组全血还原黏度(低切、中切)、血浆还原黏度(低切、中切)、聚集指数水平均显著上升(P<0.05或P<0.01)，高龄模型组全血还原黏度(高切)和血浆还原黏度(高切)水平显著上升(P<0.05)；与高龄假手术组比较，高龄模型组全血还原黏度(低切、中切、高切)、血浆还原黏度(低切、中切、高切)水平和聚集指数水平均显著升高(P<0.01)。

表3 各组大鼠血液流变学指标比较

3.6 各组大鼠血清NO、ET-1、E2、T水平变化

表4示，与低龄假手术组比较，低龄模型组、高龄假手术组与高龄模型组NO和T水平显著降低，ET-1水平显著升高(P<0.05 或P<0.01)，高龄模型组E2水平显著下降(P<0.05 或P<0.01)；与高龄假手术组比较，高龄模型组NO水平降低，ET-1水平升高(P<0.05)；与低龄模型组比较，高龄模型组NO和T水平降低，ET-1水平升高(P<0.05或P<0.01)。

注：A.低龄假手术组；B.低龄模型组；C.高龄假手术组；D.高龄模型组图2 各组大鼠海马病理形态比较(NISSL×200)

表4 各组大鼠血清NO、ET-1、E2、T水平比较

3.7 各组大鼠血清Ca、P和BGP水平的变化

表5示，与低龄假手术组比较，高龄模型组Ca和BGP水平显著下降，P水平显著升高(P<0.05)；与高龄假手术组比较，高龄模型组Ca和BGP水平显著降低，P水平显著升高(P<0.05)。

表5 各组大鼠血清Ca, P和BGP水平比较

4 讨论

国内外有多种VD动物模型的制备方法，其中双侧颈总动脉阻断法(2-VO)是一种常见的造模方法，脑组织缺血导致神经元损害为VD病理机制，其中脑海马对缺血缺氧尤为敏感，为导致学习记忆能力下降的重要原因[3]。该方法通过结扎双侧颈总动脉造成大鼠全脑持续性血供减少，慢性脑灌注不足，脑皮质及脑海马区域对缺血性损伤尤为敏感，从而导致大鼠学习记忆功能障碍。该方法手术操作简单，创伤较小且大鼠术后死亡率低，与临床脑缺血导致VD机制一致[2]。疾病模型虽能较好地模拟疾病发生的病理过程，但无法反映中医证候特点和中医药治疗优势，因此制备病证结合模型，对于评估中药干预疗效、探讨中药作用机制具有重要意义。课题组前期的研究表明[4], 肾精亏虚证和瘀血阻络证是VD患者中常见的证候类型，而肾精亏虚证和瘀血阻络证(即肾虚血瘀证)是常见的证候组合形式。目前肾虚血瘀证候模型的制备，多采用血瘀证动物模型叠加肾虚证动物模型的方法，如郭尔楚等[5]采用腹腔注射氢化可的松与肾上腺素的方法，复制肾虚血瘀证树鼩动物模型，但该模型形成机制与人类证候的形成机制差异较大。

本研究采用52周高龄大鼠双侧颈总动脉永久性结扎，试图建立VD肾虚血瘀证病证结合模型。高龄大鼠与VD中老年人患病率较高的临床特点相一致，双侧颈总动脉永久性结扎，可造成慢性全脑缺血，符合VD的病因学特点。动物表征显示，低龄模型组和高龄模型组均可出现活动不灵活、反应迟钝、大便异常等表现，高龄模型大鼠具有体毛晦暗、舌质紫暗、尾巴有不同程度紫或黄褐色斑等瘀血阻络特点，同时具有体质量增长缓慢、自主活动减少、喜卧、腰背蜷缩、体毛枯疏等肾精亏虚特点。

中医认为肾藏精，精生髓充脑，主生殖和生长发育，肾精亏虚可出现生殖功能低下、生长发育迟缓等表现。《素问·上古天真论篇》论及男子五八“肾气衰，发坠齿槁”，年龄增长而伴随的肾精不足是导致脑衰老的重要原因。俞征宇等调查了878例中老年人，结果发现肾虚证候发生率随着年龄增长而显著升高[6]。研究表明，肾虚与神经-内分泌-免疫网络系统(HPAT)的功能失调有密切联系，HPAT轴功能紊乱、骨代谢异常是肾虚的两个主要方面[7]，受孕雌鼠数[8]、睾丸指数、产仔数均可反映大鼠生殖能力。E2、T为反映性腺轴功能的指标，E2可增加脑血流量，促进损伤的脑细胞修复，增强胆碱能神经元功能进而改善学习记忆能力[9]。T与认知能力关系密切，有利于提高记忆力和空间认知力，并可改善短期及长期健忘症的记忆功能[10]。老年人普遍存在“生理性肾虚”状态，E2、T较青壮年降低，而VD患者下降更加明显，且与痴呆严重程度相关[11]。BGP是由成骨细胞合成并分泌的能结合钙离子的非胶原蛋白，为反映骨代谢的特异性指标，血清中BGP水平与骨组织中BGP含量呈正相关[12]，是骨质矿化的特殊标志物。Ca是骨质矿化的基本物质，P可促进骨矿物质沉积和骨基质的合成，改变骨细胞对Ca的摄入，体内Ca与P受内分泌激素的调节，从而在一定范围内保持平衡[13]。本研究表明，与低龄假手术组比较，低龄模型组和高龄模型组大鼠均表现产仔数显著减少，T水平显著降低，体质量增加缓慢，但高龄模型组大鼠同时表现为受孕雌鼠数显著减少，睾丸指数显著降低，E2、Ca及BGP水平均显著降低，同时与肾精亏虚证所表现的生长发育迟缓、生殖功能低下、肾主骨功能低下的证候特点一致，说明高龄模型组大鼠肾虚表现更为显著。这也与中医“年过四十，而阴气自半”，肾精随着年龄而自然衰减的认识相一致。

本研究中，2-VO手术本身可使实验大鼠出现应激反应，表现为高凝状态及高黏滞状态[6]。血瘀证时血行不畅，脉道拥塞，机体血液动力学发生改变，血液流变学相应表现出“黏”“凝”“浓”“聚”等特点[14]。NO和ET-1是血管内皮细胞分泌的一对血管舒缩因子，当血管内皮损伤时，NO生成与释放减少，导致血管舒张功能障碍，加速血小板的聚集与黏附，并刺激内皮细胞生成释放过多的ET-1。ET-1是一种具有收缩血管作用的多肽，NO与ET-1之间的平衡失调导致血管舒缩功能异常，血小板聚集，内皮细胞渗透性增加，炎症因子生成，最终导致血液高凝状态[15]。本研究表明，低龄模型组和高龄模型组大鼠均存在血液流变学指标异常、NO水平降低、ET-1水平升高，说明这两种模型均符合中医瘀血阻络证所表现的证候特点。

综合上述，高龄模型组大鼠在动物表征、微观指标变化上，与肾虚血瘀络证候特点相一致。但该模型也存在不足，如采用高龄大鼠造模会导致动物死亡率升高，可能限制该模型的推广应用。另外在评价指标上，未对各组大鼠骨密质情况进行比较，也未对该模型进行补肾活血方药的干预反证，今后尚需对该模型开展深入评价。