李荣科，颜春鲁,2△，安方玉,2，刘永琦,2，刘雪松，赵文坤，杨晓蓉

(1. 甘肃中医药大学，兰州 730000； 2. 敦煌医学与转化教育部重点实验室，兰州 730000)

泌尿系结石是泌尿外科的常见病和多发病，严重威胁患者的生活质量[1]。 研究表明，草酸钙引起的肾结石在泌尿系结石中约占80%左右[2]，其中，自由基堆积引起的氧化应激损伤是导致草酸钙结石发生的重要原因[3]。大量研究发现，肾结石形成过程中会发生超氧化物歧化酶(SOD)活性明显下降，丙二醛(MDA)含量明显升高[4]，说明肾结石形成过程中伴随着自由基的代谢紊乱。但这种损伤是通过何种信号通路调控的机制仍无法解释。为此，本研究以乙二醇联合氯化铵连续灌胃28 d制作大鼠草酸钙结石模型，并用敦煌医方瞿麦汤对肾结石大鼠进行干预，观察敦煌医方瞿麦汤对肾结石模型鼠Nrf2-NQO1信号通路中Nrf2和NQO1基因表达的影响，初步揭示敦煌医方瞿麦汤的干预机制，为敦煌医方瞿麦汤的临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠60只，体质量(180±20)g，购自甘肃中医药大学科研实验中心动物饲养室(合格证号 SCXK(甘)2011-0001)。本实验已通过甘肃中医药大学科研实验中心实验动物伦理委员会审查。

1.2 试剂

钙(Ca2+)试剂盒、磷(P)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为 20171023、20171023、20171105、20171021)；Trizol Reagent 试剂(美国，批号 47123)；GoScript TM Reverse Transcription System 试剂盒和 GoTaq qPCR Master Mix 试剂盒(Promega，批号分别为0000073135和 0000121531)；GAPDH、Nrf2和NQO1引物(均由 TaKaRa 宝生物工程(大连)有限公司设计并合成)，其序列如下：GAPDH上游引物 5′-TGAAG GTCGCTGTCAACGGA-3′，下游引物 5′-GATGGC ATGGA CTGTGGTCAT-3′；核转录因子2(Nrf2)：上游引物 5′-TTGGCAGAGACATTCCC ATTTGTA-3'，下游引物 5′-GAGCTATCGAGTGA CTGAGCCTGA-3′′； NAD (P) H 醌氧化还原酶 1(NQO1)上游引物 5′-TGGAAGCTGCAGACCTG GTG-3′，下游引物 5′-CCCTTGTCATACATGGT GGCATAC -3′。

1.3 仪器

FA2004 N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；V1500型可见分光光度计(上海美析仪器有限公司)；ZY12306型微量加样器(Scien TiFic公司)；TDZ5-WS型医用离心机(湖南平凡科技有限公司)； Q5000 超微量紫外可见分光光度计(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；S1000TM Thermal Cycler(BIO-RAD)；7500 Real Time PCR System(英潍捷基(上海)贸易有限公司)。

1.4 药物

瞿麦汤组成：瞿麦15 g，石韦30 g，滑石30 g，石膏30 g等。具体换算方法可以参考文献[5]，瞿麦汤人常用剂量是105 g/d，换算成标准体质量大鼠的剂量：105×0.018=1.89 g/鼠，按照大鼠的标准体质量为200 g，则大鼠的剂量1.89 g×5≈9.45 g/kg。换算成大鼠中剂量：105×0.018×5≈10 g/kg，敦煌医方瞿麦汤高、中、低剂量分别为20、10、5 g/kg。肾石通颗粒(修正药业集团股份有限公司，国药准字Z22021933，批号Z720382)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药

将60只SPF级SD雌性大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、肾石通颗粒组、敦煌医方瞿麦汤高、中、低剂量组每组各10只。参照文献[6]，结石组及干预组采用1%乙二醇+2%氯化铵的混合液每日2 mL灌胃，连续28 d；造模同时给予药物干预，肾石通颗粒组给予肾石通颗粒(2.7 g/kg)灌胃治疗，敦煌医方瞿麦汤组按高、中、低剂量(20、10、5 g/kg)灌胃治疗，假手术组和模型组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃，每日1次，连续4周。末次给药24 h后称量各组动物体质量，股动脉处死动物摘取动物的肾脏备用。

2.2 指标测定

2.2.1 动物体质量及肾指数测定 称量各组大鼠体质量、肾脏质量并计算肾指数。肾指数(mg/g)=肾质量(mg)/体质量(g)。

2.2.2 血清生化指标测定 末次给药后，股动脉采血静置2～3 h，1500 r/min离心10 min，分离血清。比色分析法检测血清Ca2+、P含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.2.3 肾组织SOD活性和MDA含量测定 称取肾脏200 mg，用1.8 mL生理盐水研磨组织，制备10%的匀浆液，取上清备用。比色分析法检测肾组织SOD活性和MDA含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.2.4 肾组织Nrf2和NQO1mRNA表达测定 用RNA抽提试剂提取肾组织RNA，Q5000测定 RNA 含量。按Promega 试剂盒说明书步骤合成 cDNA 第一链，按Promega实时荧光定量试剂盒操作说明书进行 PCR 反应。反应条件：预变性 95 ℃、2 min， 变性 95 ℃、15 s，退火 58 ℃、45 s，延伸 60 ℃、 1 min，共 45 个循环。每个样品各重复 3 次，数据经 2-ΔΔCt处理后进行Nrf2和NQO1基因相对表达量分析。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 对肾草酸钙结石模型大鼠体质量及肾指数的影响

表1示，与空白对照组比较，模型组大鼠体质量明显降低，肾指数明显升高(P<0.05)；与模型组比较，敦煌医方瞿麦汤各干预组大鼠体质量明显升高，肾指数显著降低(P<0.05)。

表1 敦煌医方瞿麦汤对肾草酸钙结石模型大鼠体质量及肾指数的影响

3.2 对肾草酸钙结石模型大鼠血清Ca2+、P含量和肾组织SOD活性、MDA含量的影响

表2示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清Ca2+含量和肾组织MDA含量均显著升高，SOD活性明显下降(P<0.05)；与模型组比较，敦煌医方瞿麦汤各干预组大鼠血清Ca2+含量和肾组织MDA含量均显著降低，SOD活性均明显升高(P<0.05)。

表2 敦煌医方瞿麦汤对肾草酸钙结石模型大鼠血清Ca2+、P含量和肾组织SOD活性、MDA含量的影响

3.3 对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织Nrf2和NQO1mRNA表达的影响

表3示，与空白对照组比较，模型组肾组织Nrf2和NQO1mRNA表达明显降低(P<0.05)；与模型组比较，敦煌医方瞿麦汤中、高剂量组大鼠肾组织Nrf2和NQO1mRNA表达明显升高(P<0.05)。

表3 敦煌医方瞿麦汤对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织Nrf2和NQO1mRNA表达的影响

4 讨论

泌尿系统结石是一种发病机制未明的多因素疾病，其中尿液中高浓度的草酸盐和钙离子结合形成的草酸钙是形成尿石症的重要原因。乙二醇和氯化铵两类化学试剂通过不同的作用机制诱发肾结石形成，乙二醇主要通过自身代谢产生的草酸经肾小管排泌作用造成肾小管及肾间质损害，诱发肾结石，氯化铵则是通过酸化尿液促进草酸钙结晶的析出而诱发肾结石[7]。本实验采用1%乙二醇+ 2%氯化铵对大鼠进行灌胃造模，经造模28 d 后可致大鼠血清中Ca2 +含量明显升高。而经敦煌医方瞿麦汤治疗后不同程度地降低血清中 Ca2 +浓度，抑制大鼠肾草酸钙结石。

当肾形成草酸钙结石以后，会损伤肾小管上皮细胞，促使体内自由基的产生增加，减弱机体对自由基的清除能力，从而造成组织结构的损伤。超氧化物歧化酶(SOD)是机体内重要的抗氧化酶系，主要通过清除机体的自由基而维持机体氧化和抗氧化之间的动态平衡，丙二醛(MDA)则是机体脂质过氧化的产物。因此， SOD和MDA是检测机体氧化应激反应的标志性指标[4]。在氧化应激反应的调控信号通路中，Nrf2/ARE信号通路发挥着关键作用[8]。Nrf2是一种发挥细胞自我保护作用的重要转录因子。Nrf2既是生理条件下细胞自我保护的转录因子，还是机体在病理状态下发挥重要的抗氧化应激和防御外源性有毒物质入侵的感受器[9]。ARE作为机体重要的抗氧化反应元件发挥作用。研究证实，Nrf2与ARE结合通过启动Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶基因表达来保护机体组织细胞的正常功能[10]。在氧化应激状态下，机体 Nrf2 激活ARE的基因序列，上调其下游相关因子NQO1、HO-1、 γ-GCS等表达，从而发挥自身抗氧化应激的作用[11]。在实验中，1%乙二醇+ 2% 氯化铵可显著降低模型组大鼠肾组织SOD活性，Nrf2和NQO1 mRNA的相对表达，升高其MDA的含量，证明造模剂可造成大鼠肾组织抗氧化功能及自主防御功能的破坏。而给予敦煌医方瞿麦汤干预治疗，可提高大鼠肾组织SOD 活性、Nrf2和NQO1 mRNA 的相对表达，降低其MDA含量，从而减少氧化产物的堆积，提高机体抗氧化水平，减轻大鼠肾小管的氧化应激反应，从而改善肾脏的生理功能。

肾结石属于中医学“石淋” “砂淋”等范畴[12]，其病机主要为湿热蕴结、气滞血瘀等[13]。本研究采用的敦煌医方瞿麦汤，主要由瞿麦、石韦、滑石、石膏组成。方中瞿麦具有破血通经、清热利水的功效；石韦具有清肺止咳、凉血止血、利尿通淋之功效；滑石具有清解暑热、利水通淋的功效；石膏具有清热泻火、止血收湿之功效，诸方合用共奏清热利湿、活血散瘀、通石排淋之功效。上述一系列实验结果进一步证实，瞿麦汤对治疗肾结石有效。

综上所述，敦煌医方瞿麦汤可通过降低大鼠血

清Ca2+浓度和上调Nrf2/NQO1通路相关功能蛋白表达，改善肾脏氧化应激损伤，抑制草酸钙结石的形成，从而发挥肾损伤的保护作用。