张 军，孙佳佳，刘 颖，赵 静，袁 洁，戴金颖，王顺意

(1. 河北省唐山市中医医院，河北 唐山 063000； 2. 华北理工大学，河北 唐山 063210)

胰岛β细胞功能受损和胰岛素抵抗是2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)发生发展的主要病理生理学特征[1]。胰岛β细胞功能受损被认为是T2DM发病机制的中心环节[2]。因此，修复胰岛β细胞功能成为治疗T2DM的关键。胰岛素是人体内惟一具有降糖作用的激素，磷酸化磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是细胞内重要的信号传导通路。研究发现，该通路存在于胰岛β细胞内，为胰岛素信号通路之一[3]。 磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent protein kinase 1, PDK1)是该通路中的关键蛋白因子，它在维持胰岛β细胞增殖生长中起重要作用。近年来热点研究发现，根据中医辨证论治理论使用益气养阴活血中药可有效改善胰岛β细胞功能。本实验旨在通过测定胰岛细胞中 PI3K、 PDK1蛋白表达，探讨益气养阴活血方改善T2DM大鼠胰岛β细胞功能的可能作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级8周龄健康雄性SD大鼠60只，体质量(220±20)g，饲养于华北理工大学动物实验中心(动物许可证号SCXK(京)2017-0001)，室温20 ℃～25 ℃，湿度45%～60%，光照节律(12 h/12 h)，实验过程中动物自由摄食饮水。本实验已通过华北理工大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 药物

益气养阴活血方组成：黄芪12 g，黄精12 g，太子参12 g，当归12 g，鬼箭羽15 g，丹参20 g，三七3 g，地黄12 g，葛根15 g，牡丹皮10 g等(选用广东一方制药有限公司生产的中药免煎颗粒，购自唐山市中医医院)。

1.3 主要试剂和仪器

生理盐水(石家庄四药有限公司)；链脲佐菌素(美国Sigma公司)；大鼠胰岛素ELISA试剂盒(美国ADL公司)；兔源PI3K多克隆抗体(bs-0128R)、兔源PDK1多克隆抗体(bs-3788R)(北京博奥森生物科技有限公司)；羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BCA法蛋白定量试剂盒(杭州联科生物有限公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)。

血糖仪及配套试纸(德国拜耳公司拜安进血糖仪)；离心机(美国Thermo Fisher科技公司)；Shandon325型石蜡切片机(英国Shandon公司)；DYY-7型转移电泳仪(北京市六一仪器厂)；恒温震荡摇床(上海福玛实验设备有限公司)；Image Pro Plus图像分析软件(美国Media Cybemetics公司)。

2 方法

2.1 T2DM大鼠模型建立

60只大鼠分笼处理，普通饲料喂养7 d。随机选取正常组(normal control,NC组)10只喂以普通饲料，造模组50只喂以高脂饲料，连续28 d。在第29天，将大鼠禁食12 h并向模型鼠腹腔内一次性注射35 mg/kg STZ溶液(溶于PH 4.5 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液)。造模大鼠72 h后尾静脉取血，测血糖值16.7 mmol/L作为T2DM模型造模成功的标准。7 d后对未达标准的大鼠进行再次注射STZ处理，仍未达到16.7 mmol/L标准的大鼠有2只被剔除。

2.2 分组及药物干预

成功建模的48只大鼠按体质量分层，按随机数字表法分为模型组(diabetes mellitus,DM)、津力达组(jinlida,JLD)、益气养阴活血方高剂量组(yiqi yangyin huoxue prescription-high dose, YYHP-H)、中剂量组(yiqi yangyin huoxue prescription-middle dose, YYHP-M)、低剂量组(yiqi yangyin huoxue prescription-low dose, YYHP-L)。于每日上午9时灌胃，正常组和模型组给予相同体积的生理盐水，津力达组以1.5 g/(kg·d)灌胃，益气养阴活血方低剂量组按成人剂量的6.25倍，以4∶2∶1给药，即高剂量组(55.00 g/kg)、中剂量组(27.50 g/kg)、低剂量组(13.75 g/kg)，将中药颗粒溶于适量水中，每只大鼠以2 mL/d给药干预28 d。由于造模及灌胃过程中的损耗，除正常组外最终有43只大鼠纳入统计，其中NC组10只，DM组9只，JLD组8只，YYHP-H组9只，YYHP-M组9只，YYHP-L组8只。

2.3 指标检测

2.3.1 空腹血糖测定 应用拜耳公司血糖仪及配套试纸尾尖采血定期测定大鼠FBG。

2.3.2 ELISA法测定空腹胰岛素(fasting insulin，FINS) 最后1次给药后将大鼠禁食，次日上午8时进行麻醉、固定、解剖，腹主动脉取血、静置、离心、分离血清，稀释样品，向已经包被过空腹胰岛素抗体的酶样板中加入样品和标准品，室温孵育1 h加入二抗、HPR，分别经过覆盖、孵育后加入显色底物，室温避光反应30 min，加入终止液。终止反应后进行OD值检测，绘制标准曲线，最终计算得出实际样本浓度。

2.3.3 HOMA-IR及HOMA-β计算 根据已测定的血清胰岛素水平计算胰岛素抵抗指数(homeostatic model assessment insulin resistance, HOMA-IR)及胰岛素分泌指数(Islet β cell secretion index, HOMA-β)，计算公式如下：胰岛素抵抗指数[4]：HOMA-IR=(FBGxFINS)/22.5；胰岛素分泌指数[5]：HOMA-β=FINS×20/(FBG-3.5)。

2.3.4 免疫组化法测定胰岛细胞中PI3K、PDK1蛋白表达 将部分胰尾组织进行固定、脱水、透明、浸蜡包埋后切片，通过sp法进行免疫组织化学染色，将4 μm石蜡切片常规脱蜡再水化，柠檬酸修复液高压修复抗原，双氧水清除内源性过氧化物酶，滴加10%山羊血清封闭30 min。滴入一抗(PI3K 1∶500,PDK1 1∶500)，湿盒4 ℃孵育过夜，除去一抗逐滴加入二抗，并在37 ℃继续温育20 min。滴加DAB，在显微镜下监测染色程度，苏木素复染，1%盐酸酒精分化几秒，反蓝，脱水、透明、封片，光镜下观察蛋白表达，免疫组化结果应用Image Pro Plus(IIP)6.0软件进行半定量分析，测定PI3K、PDK1平均光密度。

2.3.5 蛋白免疫印迹法测定胰岛细胞中PI3K、PDK1的蛋白表达 将部分液氮处理后的胰尾组织裂解，离心提取上清后按BAC试剂盒说明操作进行蛋白定量，剩余蛋白样品加上样缓冲液沸水浴变性稍离心。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，恒压、转膜各2 h，取下带有蛋白质的PVDF膜，5%脱脂奶粉摇床封闭。加一抗(PI3K 1∶1000,PDK1 1∶1000)4 ℃静置过夜，TBS摇床清洗，加入二抗室温摇床孵育，ECL化学发光并显影定影。图片扫描后，应用Image Pro Plus(IIP)6.0 图像分析软件进行蛋白灰度分析，以目的条带与内参β-tubulin条带的灰度值之比作为各目的蛋白的相对表达。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠血清FBG、FINS及HOMA-IR、HOMA-β检测结果

表1示，与正常组比较，模型组FBG和HOMA-IR水平显著升高，FINS和HOMA-β水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，津力达组和益气养阴活血方各剂量组FBG水平下降，FINS和HOMA-β水平升高，益气养阴活血方中剂量组HOMA-IR水平降低(P<0.01)，其余各给药组HOMA-IR水平也有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与津力达组比较，益气养阴活血方各剂量组FBG水平均有不同程度降低，FINS和HOMA-β水平均有不同程度升高，而以中剂量组效果最佳(P<0.05，P<0.01)。

表1 各组大鼠血清FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β水平比较

注：A1. 正常组；B1. 模型组；C1. 津力达组；D1. 高剂量组；E1. 中剂量组；F1. 低剂量组图1 各组大鼠胰腺组织胰岛细胞内PI3K蛋白表达(×400)

3.2 免疫组化法测定大鼠胰腺组织胰岛细胞内PI3K、PDK1蛋白表达

图1、2示，在光学显微镜下观察，PI3K、PDK1在胰岛细胞中的表达区域为棕黄色，主要在细胞质和细胞膜表达。正常组的PI3K、PDK1蛋白阳性表达最高，染色为深棕色(A1、A2)；模型组的阳性表达最少，染色为浅黄色(B1、B2)；与模型组比较，津力达组和益气养阴活血方各剂量组蛋白表达均有所增强，其中中剂量组表达增强最明显(C1-F1,C2-F2)。表2示，应用图像分析系统分析计算各组图片的平均光密度值，结果显示与正常组比较，模型组PI3K、PDK1蛋白的表达降低(P<0.01)；与模型组比较，津力达组和益气养阴活血方各剂量组PI3K、PDK1蛋白表达明显升高(P<0.01，P<0.05)；与津力达组比较，益气养阴活血方中剂量组PI3K蛋白表达升高(P<0.05)，益气养阴活血方各剂量组PDK1蛋白表达均存在不同程度的升高(P<0.05)，而以中剂量组效果最优(P<0.05)。

表2 各组大鼠胰腺组织胰岛细胞内PI3K、PDK1蛋白表达水平比较

3.3 免疫蛋白印迹法测定大鼠胰腺组织胰岛细胞内PI3K、PDK1蛋白表达

图3示，与正常组比较，模型组胰岛细胞中PI3K、PDK1蛋白表达降低(P<0.01)；与模型组比较，津力达组及益气养阴活血方各剂量组胰岛细胞中PI3K、PDK1蛋白表达升高(P<0.01)；与津力达组比较，益气养阴活血方各剂量组PI3K、PDK1蛋白表达明显升高(P<0.01)，而以中剂量组效果最佳(P<0.05)。

4 讨论

2型糖尿病是环境和遗传因素共同作用形成的异质性糖代谢性疾病，其发病机制的2个重要环节是胰岛β细胞功能受损和胰岛素抵抗。胰岛素分泌功能的降低和胰岛β细胞数量的减少是胰岛β细胞功能受损的主要表现。英国UKPDS表明，患者诊断为糖尿病时其胰岛β细胞功能只有正常人的一半，并以每年4%～5%的速度下降[6]。因此，改善胰岛β细胞功能和数量已成为治疗2型糖尿病的关键。

注：与NC组比较：△△P<0.01；与DM组比较：**P<0.01；与JLD组比较：◇◇P<0.01；与中剂量组比较：▽P<0.05，▽▽P<0.01图3 各组大鼠胰腺组织胰岛细胞内PI3K、PDK1蛋白表达比较

糖尿病属于中医学“消渴病”范畴。《灵枢·五变》记载：“五脏皆柔弱者，善病消瘅”，《医方考》[7]记载“消渴，无水也”，指出先天禀赋不足阴虚燥热而致消渴，气虚运血无力、燥热耗伤津液而致瘀血内生，形成气阴两虚兼瘀之证，其为2型糖尿病的主要证型，与临床相关调查结果一致[8]。本研究将中医辨证论治与现代药理相结合，选用已在临床中大量应用且被证实能有效降糖的自拟益气养阴活血方。方中黄芪、太子参大补元气；丹皮、葛根、地黄、黄精生津凉血，气阴双补；当归、鬼箭羽、丹参、三七补血活血化瘀，益气养阴与活血化瘀药物相配伍，起到补不碍邪、攻不伤正、标本同治之功。方中黄芪葛根配伍，不仅能够降低炎症因子IL-6水平，改善炎症状态，还能通过提高胰岛素水平从而控制血糖，效果均优于单一用药[9]。黄精多糖可上调胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate 2,IRS-2)的表达，改善胰岛素抵抗状态，抑制胰腺免疫损伤和自由基损伤，减少胰岛β细胞凋亡，降低高糖状态，抑制糖尿病并发症的发生[10]。鬼箭羽具有调节糖脂代谢、改善血液流变学的作用，对血瘀证2型糖尿病具有明显的治疗作用[11]。丹参多酚盐通过增加抗氧化酶的活性，进而发挥抗氧化应激作用来修复胰岛β细胞[12]。目前西药类降糖药对胰岛β细胞功能的保护机制尚不明确，因此对照组药物选用具有益气养阴、生津健脾功效的津力达颗粒。津力达颗粒以“运脾津”为治则，组方中君药为人参益气健脾，气旺津生；黄连、苍术、苦参清热燥湿；麦冬、黄精补脾养阴；佩兰芳香醒脾；茯苓、知母养阴畅脉；荔枝核行散滞气；淫羊藿温补脾经肾经阳气；何首乌、山萸肉补肝肾之阴，加用丹参祛瘀生新，全方具有益脾气、养脾阴、通脉络的配伍特点。与本实验所用中药方组方原则相近。大量动物实验及临床实验[13-14]也证实,津力达颗粒可有效促进T2DM胰岛细胞恢复，增加胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗，控制血糖,其作用明确，无明显低血糖和肝肾损害等不良反应，存在良好可比性。

PI3K/Akt信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是胰岛素发挥作用的主要途径。其中 PI3K/Akt作为促生存信号通路，在胰岛细胞增殖、生长和凋亡过程中起重要作用。PI3K是胰岛素信号朝向调节糖代谢方向传导的关键信号分子，其处于胰岛素受体底物IRS后，胰岛细胞内的胰岛素与胰岛素受体(insulin receptor,IR)结合使其自身磷酸化并与IRS结合，IRS与PI3K的p85调节亚基结合使 PI3K被激活催化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate,PIP3)，其产物PIP3被认为是胰岛素第二信使。PDK1、PDK2作为PI3K的下游信号分子，在PIP3作用下活化并将Akt蛋白聚集到细胞膜上，在PDK1作用下分别使Akt蛋白上的第437位丝氨酸磷酸化位点(Ser437)和第308位苏氨酸磷酸化位点(THr308)发生磷酸化，激活Akt信号通路[15]。相关实验证明，激活PI3K/Akt信号通路可以保护胰岛β细胞，促进胰岛素分泌，有效调节血糖[16]。

本实验研究采用STZ诱导建立2型糖尿病大鼠模型，结果表明，益气养阴活血方可有效调节血糖，促进胰岛素分泌。免疫组化结果显示，益气养阴活血方高、中、低剂量组的大鼠胰岛细胞中PI3K和PDK1蛋白表达均有不同程度升高；蛋白印迹法结果与其相一致，且中剂量组效果最佳。另有袁洁等[17]对益气养阴活血方治疗的大鼠胰岛细胞行HE染色，结果显示，胰岛细胞均有不同程度的改善，胰岛细胞中miRNA-375表达水平明显下降。Ouaammari[18]等发现，miR-375能够通过抑制PI3K、PDK1的表达，调节葡萄糖诱导的生物学效应，提示益气养阴活血方对胰岛β细胞功能的改善作用，可能是通过下调胰岛细胞中miRNA-375的表达，进而激活PI3K/Akt信号通路，促进其下游关键蛋白PDK1蛋白表达来实现的。此外本实验结果显示，实验大鼠胰岛细胞受损和胰岛素抵抗同时存在，益气养阴活血方在改善胰岛细胞功能和胰岛素抵抗方面均有明显优势。

综上所述,益气养阴活血方能够增强T2DM大鼠胰岛细胞内PI3K、PDK1蛋白表达，促进胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗状态，有效降低大鼠血糖；其修复胰岛β细胞功能的作用机制可能是通过提高PI3K和PDK1蛋白表达、激活PI3K/Akt信号通路来实现的。