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(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002;2.福建农林大学菌物研究中心,福建福州 350002)

2-苯基乙醇是一种玫瑰香型的风味物质,世界每年产量约10000吨[1],有抑菌、抗肿瘤、强心的作用[2-4];它还是合成一些高附加值药物比如苯乙醇苷的底物,故2-苯基乙醇在医药卫生领域也有重要应用[5]。除此之外,2-苯基乙醇作为香味物质在饮料[6]、香水以及化妆品[7]中应用较多。天然2-苯基乙醇可以在玫瑰花瓣中提取得到,但是成本过高,得率较低[8-9],因此目前主要通过化工合成的方式来获得,由于化工合成的过程中会含有苯类以及乙烯类有毒有害物质,添加到食品中会对食品安全造成一定的威胁[10-11],因此生物合成2-苯基乙醇的方式成为当今研究的热点。

目前发现生物合成2-苯基乙醇的方式是利用酿酒酵母的艾里希通路(Ehrlich pathway),通过L-苯丙氨酸生物转化合成2-苯基乙醇或者利用碳源从头合成[12-13],也可以通过基因工程[14-15]、酵母菌株杂交[16]、原位产物提取[17]等方法来提高2-苯基乙醇的生物合成量。除此之外,发现香灰菌也可以利用L-苯丙氨酸生物转化合成2-苯基乙醇。经鉴定,香灰菌(Hypoxylon sp.)为子囊菌亚门碳团菌属的真菌[18-20],是银耳的伴生菌[21],只有与香灰菌共生培养时才有生长能力[22-23]。为了研究香灰菌如何利用L-苯丙氨酸生物合成香味物质2-苯基乙醇,建立一种准确的检测香灰菌发酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇含量的方法尤为重要。

目前L-苯丙氨酸的检测方法主要有GSP分析仪和试剂盒等方法,主要应用于医疗临床研究,尤其是在新生儿干燥血片苯丙氨酸的含量与新生儿胎龄体重的关系方面[24-26],针对发酵液中L-苯丙氨酸含量的检测目前报道不多。发酵液中2-苯基乙醇的检测方法目前有紫外分光光度法[27]、气相色谱分析法[28-29]以及气质联用法[30],同时检测发酵液中2-苯基乙醇和L-苯丙氨酸含量的相关研究较少。刘东亚等[31]利用高效液相色谱法对酵母菌发酵液进行了检测,将该检测方法应用于香灰菌发酵液的检测时,发现存在以下问题:一方面,L-苯丙氨酸出峰较早,不能很好的与杂峰分离;另一方面,L-苯丙氨酸解离容易形成拖尾峰,这些均影响结果的准确度,此外流动相甲醇∶水=1∶1会导致柱压较高,对色谱柱和仪器损伤较大。

鉴于以上问题,本文拟建立一种新的同时检测香灰菌发酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的方法,通过改变不同时间段流动相的配比,以期使L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇与杂质峰分离,并且使L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇分离开来,实现一个样本同时对两种物质进行检测;另外,流动相中加入弱酸,拟解决L-苯丙氨酸峰拖尾问题,为今后香灰菌生物转化合成2-苯基乙醇的研究和开发提供依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料与仪器

2-苯基乙醇标准品 纯度>99.5%,阿拉丁试剂(上海)有限公司;L-苯丙氨酸标准品 纯度>99%,上海麦克林生化科技有限公司;甲醇 色谱纯,默克化工技术(上海)有限公司;超纯水 电导率18.25 MΩ;PDA培养基 马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，水1000 mL;发酵培养基 马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，L-苯丙氨酸4 g/L，水1000 mL。

LC20AD高效液相色谱仪配可变波长紫外检测器、Inert Sustain C18色谱柱 岛津公司;SB25-12DTDN超声波清洗 宁波新芝生物科技有限公司;LE104E/02分析天平 METTLER TOLEDO,精度0.1 mg;有机系0.45 μm微孔过滤膜 津腾;ZQTY-70N恒温摇床 上海知楚仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验溶液的配制

1.2.1.1 标准储备液的制备 准确称取0.5 g L-苯丙氨酸,用移液枪吸取0.5 mL 2-苯基乙醇(ρ=1.02 kg/L),用0.6%的乙酸溶液将L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇定容于50 mL容量瓶中,配制成标准混合储备液,其中L-苯丙氨酸的浓度为10 g/L,2-苯基乙醇的浓度为10.2 g/L。

1.2.1.2 标准工作溶液的制备 于5只10 mL容量瓶中分别加入1、2、3、4、5 mL标准混合储备液,并用0.6%的乙酸溶液定容,得到浓度梯度为1、2、3、4、5 g/L的L-苯丙氨酸和浓度梯度为1.02、2.04、3.06、4.08、5.10 g/L的2-苯基乙醇标准混合液,标准混合液过0.22 μm有机系微孔滤膜后待上机检测。

1.2.1.3 香灰菌发酵液样品的制备 香灰菌菌种在PDA试管培养基上转接活化2次,将香灰菌菌种用接种针挖取约1 cm3的小块接种到含有PDA培养基的培养皿中培养4 d,在培养皿同一半径上用直径0.5 cm的打孔器打孔制备菌种块,接种至含有100 mL发酵培养基的三角瓶中,每瓶接种两块,置于28 ℃恒温摇床中,以160 r/min的振荡速度培养6 d,将发酵液4000 r/min离心10 min,取上清液0.22 μm尼龙微孔滤膜过滤,滤液即为香灰菌发酵液样品,待上机检测。

1.2.2 液相色谱条件 色谱柱:C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);柱温30 ℃;进样量10 μL;流速0.7 mL/min;DAD检测器,检测波长258 nm;流动相A:0.6%乙酸水溶液;流动相B:甲醇,流动相洗脱梯度见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

1.3 数据处理

实验数据统计分析采用SPSS 17.0,色谱采集及处理采用岛津液相色谱仪配套的LC Solution色谱处理系统。

2 结果与分析

2.1 流动相以及流动相成分的优化

分别以乙腈和甲醇作为流动相的有机相部分进行了实验,结果表明,两种溶液对L-苯丙氨酸以及2-苯基乙醇的分离效果相似,考虑到成本问题,选择甲醇作为流动相的有机相部分。分别配制了20 mmol/L的磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钠以及1%(V/V)的乙酸溶液作为流动相无机相部分进行了实验,结果如图1所示,发现四种溶液均可出现较好的峰型,无拖尾峰形成,考虑到磷酸盐溶液在色谱柱中纯甲醇的环境下容易析出导致色谱柱堵塞,最终选用乙酸溶液作为流动相。

图1 不同种类磷酸盐水溶液以及乙酸水溶液色谱图Fig.1 Chromatograms of different kinds of phosphate aqueous solutions and acetic acid aqueous solutions注:a:20 mmoL/L(M/V)磷酸二氢钾;b:20 mmoL/L(M/V)磷酸二氢铵;c:20 mmoL/L(M/V)磷酸二氢钠;d:1%(V/V)的乙酸。

同时分别以纯水、0.3%、0.6%、0.9%的乙酸溶液作为流动相无机相部分进一步实验,结果如图2所示,发现浓度0.6%、0.9%乙酸溶液均无拖尾峰形成,因此选择0.6%(V/V)的乙酸溶液作为流动相。

图2 不同浓度乙酸水溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of different concentration of acetic acid aqueous solution注:a:纯水;b:0.3%乙酸水溶液;c:0.6%乙酸水溶液;d:0.9%乙酸水溶液。

2.2 紫外检测器检测波长的确定

在200～800 nm进行全波长扫描检测L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇,结果见图3和图4,从图3和图4可知:L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇均在258 nm处有吸收峰,最终选择紫外检测波长为258 nm。

图3 L-苯丙氨酸全波长扫描光谱图Fig.3 Full wavelength scan image of L-phenylalanine

图4 2-苯基乙醇全波长扫描光谱图 Fig.4 Full wavelength scan image of 2-phenylethanol

2.3 流速的确定以及方法优化对比实验

在刘东亚等[31]方法基础上把流动相无机部分改为0.6%的乙酸水溶液,即以流动相甲醇:0.6%乙酸∶溶液=1∶1,流速1 mL/min,柱温30 ℃,C18色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),进样量10 μL,在258 nm波长下进行检测,结果如图5所示,图5a为标品色谱图,图5b为香灰菌发酵液样品色谱图,结果显示样品中L-苯丙氨酸分离效果较差,2-苯基乙醇可以分开,但峰形较宽,此时柱压较高可达17.1 MPa,柱压较高,不利于仪器的高效稳定运转,综上所述,此条件下不能高效准确的同时检测发酵液样品中两种物质的含量。

图5 两种不同方法检测色谱图Fig.5 Chromatograms of two different detect methods注:a:传统方法标品色谱图;b:传统方法样品色谱图;c:优化方法标品色谱图;d:优化方法样品色谱图。

鉴于流动相的流速问题,流速较低保留时间较长,分离效果较差。流速过高则柱压过大,因此对流动相流速0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min进行了实验,实验结果表明:流速0.8、0.9、1.0 mL/min与0.7 mL/min分离效果均较好,考虑流速过快柱压过高,最终选择流速为0.7 mL/min。

以1.2.2步骤的液相色谱条件即检测的最优条件进行检测,结果如图5c、5d所示,图5c为标品色谱图,图5d为香灰菌发酵液样品色谱图,两种物质分离效果均较好,且柱压会随时间的变化而变化,均小于17.1 MPa,有利于仪器的稳定运行与保养。该方法分离效果好,柱压低,准确高效,可以很好的同时检测发酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量。

2.4 实验方法的验证

2.4.1 标准曲线、检出限和定量限 以1.2.1.2步骤配制6个不同浓度梯度的标准溶液,在1.2.2步骤所描述最优色谱条件下进行测定,取3次平行测定的平均值,以标准液6个浓度为横坐标,峰面积为纵坐标建立标准曲线,以外标法定量,建立线性回归方程(表2),相关系数均大于0.999,线性关系良好。

表2 线性回归方程Table 2 Linear regression equation

逐步稀释标准混合溶液的浓度,上机检测,结果表明:当L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的峰高为基线噪音高的3倍和10倍时,检测限分别为1.023和0.567 mg/L,定量限分别为3.409和1.890 mg/L。

2.4.2 方法的加标回收率和精确度 按照1.2.1.3步骤的方法制备发酵液样品,在其中添加两种标准品,浓度分别为0.5、1.0、1.5 g/L,在最优色谱条件进行检测,每个样品检测6次,取平均值,得到样品的检测量,结果为L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量分别是1.023和1.109 g/L。以平均值计算加标回收率和方法的平均标准偏差,如表3所示,加标回收率在98.53%～101.58%之间,由此证明方法的准确度高。平均标准偏差在0.67%～1.22%之间,精确度较高,符合试验要求。

表3 加标回收率测定结果Table 3 Standard recovery measurement results

2.4.3 仪器精密度实验 取标准品混合液重复检测6次(表4),结果L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的RSD分别为0.18%和0.31%。由此证明仪器精密度良好。

表4 仪器精密度实验结果Table 4 The test results of instrument precision

2.5 样品分析结果

在最优色谱条件下对同批次相同条件下培养的6瓶香灰菌发酵液同时测定L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量,发酵培养基中L-苯丙氨酸的添加量均为4 g/L,每瓶香灰菌发酵液上机检测3次取平均值,结果如表5所示,发酵液中2-苯基乙醇的产量较稳定,在1.1153～1.3930 g/L之间,标准差在0.03～0.19之间,重复性良好,实验误差小,此方法可以很好的同时测定香灰菌发酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量。

表5 样品检测结果Table 5 The test results of samples

3 结论

本文通过优化高效液相色谱法可以同时检测香灰菌发酵液中的L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量,在最优检测条件下,即色谱柱:C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);柱温30 ℃;进样量10 μL;流速0.7 mL/min;DAD检测器,检测波长258 nm;流动相A:0.6%乙酸水溶液;流动相B:甲醇,流动相梯度洗脱,可以较好的分离目标检测物,线性关系良好,L-苯丙氨酸加标回收率为99.16%～101.58%,2-苯基乙醇的加标回收率为98.53%～101.06%,L-苯丙氨酸检出限和定量限分别为1.023和3.409 mg/L,2-苯基乙醇检出限和定量限分别为0.567和1.890 mg/L。该方法精确度和准确度高,简单高效,结果稳定,且可以准确高效的同时检测发酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的浓度,为利用L-苯丙氨酸生物转化合成天然香味物质2-苯基乙醇的研究和开发奠定了理论基础。