韩 笑，郭业磊，代汉仁，佟 川，陈德云，王 瑶，韩为东

解放军总医院第一医学中心 生物治疗病区/分子免疫室，北京 100853

长期以来基因组突变一直被认为是肿瘤形成的核心因素，但是近些年的研究表明，表观遗传机制在肿瘤疾病的进展中同样发挥了重要的作用[1]。DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA调节等是表观遗传修饰的主要机制，因此靶向或逆转表观遗传修饰已经成为了极具潜力的肿瘤治疗方法[2-3]。其中DNA甲基转移酶抑制剂(DNA methyltransferase inhibitor，DNMTi)能够发挥对DNMTs抑制的表观遗传效应而产生抗肿瘤作用。虽然DNMTi对肿瘤抑制基因重新激活的研究更为广泛，但有证据表明DNMTs的抑制会产生肿瘤细胞外的免疫调节作用。去甲基化修饰对于T细胞的耗竭至关重要，其能够抑制耗竭T细胞中效应细胞功能、增殖、代谢活性和组织归巢所涉及的关键基因[4-6]。最新研究也证实DNA甲基化促进了T细胞耗竭并限制了PD-1抑制剂的疗效，而DNA去甲基化则增强了PD-1抑制剂介导的T细胞再生[7]。目前有关DNMTi的研究更多集中在肿瘤细胞、T细胞以及CD8阳性T细胞亚群，对CD4阳性T细胞的研究报道较少[8-10]。去甲基化药物地西他滨(5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷；decitabine，DAC)是一种独特的胞嘧啶类似物，能抑制DNA甲基转移酶，逆转甲基化，并能在体内和体外重新激活表观遗传沉默的基因[11-12]。本研究采用体外添加DAC对CD4阳性T细胞进行修饰，观察其对CD4阳性T细胞增殖、记忆以及细胞毒性的影响，为地西他滨增强CD4阳性T细胞抗肿瘤功能的研究提供探索方向。

材料与方法

1 实验细胞 Raji细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞系，美国ATCC)。

2 主要试剂和仪器 PBS缓冲液，Buffer缓冲液(PBS+0.5%人血清白蛋白+2 mmol/L EDTA)，人外周血淋巴细胞分离液，X-VIVO15培养基(瑞士 Lonza)，IL-2(美国 PeproTech)，CD3单克隆抗体(日本Takara)，磁力分选柱，人类CD4+T细胞磁珠分选试剂盒(德国Miltenyi)，人IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-αValukineTMELISA试剂盒(美国NOVUS)，流式细胞抗体CD3-APC、CD4-FITC、CD8-PerCP、CD45RO-APC、CD62L-PE，医用离心机(中国北京京立离心机)，流式细胞仪(美国Beckman)，个人型细胞分析仪(韩国NanoEntek)，多功能酶标仪VarioskanTMLUX(美国Thermo Fisher)，CO2培养箱。

3 提取外周血淋巴细胞 采集3名25 ～ 30岁男性健康供者静脉血各60 ml(均取得健康供者知情同意)，置于抗凝管中，轻轻摇匀，取6个50 ml离心管各加入淋巴细胞分离液15 ml，然后沿管壁缓缓加入0.9%氯化钠注射液稀释的静脉血各35 ml，20℃、2 000 r/min离心20 min，吸取中间环状乳白色淋巴细胞层，PBS缓冲液洗两遍。

4 分选CD4+T淋巴细胞 将上述外周血淋巴细胞计数，每107个细胞重悬于40μl Buffer缓冲液，并加入10μl Biotin-Antibody Cocktail，混匀放入4℃冰箱5 min，加入30μl Buffer及20μl Anti-Biotin MicroBeads充分混匀放入4℃冰箱10 min。将磁力柱吸附于磁力架上，用3 ml Buffer冲洗磁力柱，将上述制备好的细胞悬液加入磁力柱中收集流出的细胞即CD4+T细胞，流式细胞仪分析CD4+T细胞的分选效率。

5 细胞培养 磁珠分选出的CD4+T细胞直接悬浮在于含有anti-CD3mAb(500 ng/μl)和IL-2(300 U/ml)的培养基中，放置于37℃ 5% CO2培养箱中。3 d后将细胞移至新的培养瓶中悬浮培养，每3 d添加新鲜的培养基及IL-2。

6 细胞增殖实验 细胞共分为6组，每组6孔。初始细胞数1×105/孔，其中CD4+T细胞组作为对照组，其他各组按照10 nmol/L、30 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 000 nmol/L添加DAC。分别于3 d、7 d、10 d和14 d使用个人型细胞分析仪进行细胞计数，以细胞数/初始细胞数作为细胞增殖倍数。通过不同浓度DAC对细胞增殖的影响，筛选出促进增殖最佳的最低剂量组。按照上述实验分组，分别在不同的时间点即0 d、1 d、2 d、5 d和7 d添加DAC，同样的方法在3 d、7 d、10 d和14 d计算细胞增殖倍数，筛选出促进增殖最佳的时间组，并最终确定添加DAC的最佳剂量和时间，为后续实验做准备。

7 细胞表型检测 上述各组细胞在7 d时用流式细胞仪检测细胞表型，以CD45RO+CD62L+作为中央记忆型T细胞(central memory Tcell，TCM)，以CD45RO-CD62L+作为干细胞样中央记忆型T细胞(stem cell-like memory Tcell，TSCM)。

8 肿瘤细胞杀伤实验 采用基于阻抗的肿瘤细胞杀伤试验(xCELLigence)来检测靶细胞的持续溶解。Raji细胞被电镀在96孔电阻底板中，每孔5×103个细胞。24 h后，加入5×104个效应细胞。共分3组，每组6孔，包括DAC处理的CD4+T细胞+Raji细胞组、CD4+T细胞+Raji细胞(对照组)以及不添加效应细胞的Raji细胞组。每15 min集测量1次基于阻抗的标准化细胞指数，监测时间为96 h。标准化细胞指数则通过测量由Raji肿瘤细胞黏附引起的晶体管平板上的电流阻抗确定。

9 细胞因子检测 细胞分2组，每组6孔，细胞数5×105/孔，包括DAC处理的CD4+T细胞和对照组CD4+T细胞。各组细胞培养7 d时，分别加入Raji细胞，细胞数5×104/孔。24 h后使用ELISA试剂盒和多功能酶标仪检测IL-2、FasL、IFN-γ和TNF-α的分泌。

10 统计学方法 使用SPSS22.0进行研究资料分析。观测资料主要为计量数据，均通过正态性检验，以-x±s描述。两组间的比较为成组t检验或校正t检验(统计量为t)，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD。检验水准α=0.05。

结 果

1 CD4+T细胞的分选效率 通过人类CD4+T细胞磁珠分选试剂盒和磁力柱对人外周血淋巴细胞进行分选，磁力柱中流出来的细胞即CD4+T细胞，经过流式细胞仪分析CD4+T细胞的分选效率为95.36% ～ 97.51%，能够达到实验所需要的纯度(流式代表图见图1)。

图1 分选CD4+ T细胞Fig. 1 Selection of CD4+ subsets from Tcells

2 添加DAC的最低剂量及最佳时间 通过不同剂量和添加时间筛选出促进CD4+T细胞增殖最佳的DAC剂量和时间：1)剂量：5种不同剂量DAC实验结果提示，3 d时各组细胞均出现增殖，其中200 nmol/L和1 000 nmol/L组细胞增殖倍数显著低于对照组(P＜0.05)，其他各组和对照组细胞的增殖倍数无统计学差异(P＞0.05)。7 d时各组与对照组细胞的增殖倍数差异显著，其中10 nmol/L、30 nmol/L和100 nmol/L组细胞增殖倍数显著高于对照组(P＜0.05)，200 nmol/L和1 000 nmol/L组细胞增殖倍数显著低于对照组(P＜0.05)。10 d时各组间细胞增殖均有统计学差异(P＜0.05)。14 d时10 nmol/L、30 nmol/L和100 nmol/L组细胞增殖倍数显著高于对照组(P＜0.05)，200 nmol/L和1 000 nmol/L组细胞增殖倍数显著低于对照组(P＜0.05)。由此筛选出促进细胞增殖效果最佳的最低DAC剂量为10 nmol/L，并作为后续实验的使用剂量(图2A)。2)时间：确定DAC添加实验剂量后，进一步实验探索DAC添加时间：分别在5个不同的时间点添加10 nmol/L DAC。结果显示，3 d时各时组间的细胞增殖均无统计学差异(P＞0.05)。7 d、10 d和14 d时，Day0、Day1和Day2组的细胞增殖倍数均显著高于对照组(P＜0.05)，而Day5和Day7组细胞增殖倍数与对照组无统计学差异。另外，Day0、Day1和Day2组的组间细胞增殖倍数以及Day5和Day7组的组间细胞增殖倍数均无统计学差异。通过实验证实，在细胞培养3 d以后添加DAC，几乎不再影响细胞的增殖。因此，由此最终确定了添加DAC的最低剂量和最佳时间为10 nmol/L、Day 0(图2B)。

3 DAC修饰的CD4+T细胞的记忆表型增强 7 d时检测记忆细胞表型(CD45RO，CD62L)。结果显示，TCM表型(CD45RO+CD62L+)较对照组显著增加(P＜0.001)，TSCM表型(CD45RO-CD62L+)较对照组也显著增加(P＜0.05)。结果提示DAC有助于提高CD4+T细胞记忆性，中央记忆型T细胞以及干细胞样中央记忆型T细胞的比例增加最为显著(图3)。

图2 不同剂量和时间点添加DAC对CD4+ T细胞增殖的影响(aP＜0.05； n=3)A： 不同剂量； B： 不同时间Fig. 2 Effect of adding DAC at different doses and time points on the proliferation of CD4+ Tcells (aP＜0.05； n=3)A: Different doses； B: Different time points

图3 低剂量DAC对CD4+ T细胞记忆表型的影响Fig. 3 Effect of low-dose DAC on memory phenotype of CD4+ Tcells (aP＜0.05； bP＜0.001；n=3)

图5 低剂量DAC对CD4+ T细胞接触肿瘤抗原后细胞因子分泌能力的影响Fig. 5 Effect of low-dose DAC on cytokine secretion of CD4+ Tcells exposed to tumor antigen (aP＜0.05； bP＜0.001；n=3)

4 DAC修饰的CD4+T细胞肿瘤溶解能力增强 通过xCELLigenceⅠ阻抗系统进行96 h效靶比(E∶T)为10∶1的杀伤实验，结果显示DAC修饰的CD4+T细胞肿瘤溶解能力优于对照组，说明DAC能够维持CD4+T细胞持续抑制肿瘤的能力(图4)。

5 DAC修饰的CD4+T细胞的细胞因子分泌增强将培养7 d的效应细胞与肿瘤细胞按照10∶1的比例进行共培养，24 h后收集培养上清进行ELISA检测。结果显示，DAC修饰后的CD4+T细胞与Raji细胞共培养后其分泌的IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-α显著高于对照组，说明DAC修饰的CD4+T细胞遇到抗原后，分泌细胞因子的能力增强，而这些细胞因子可以促进T细胞增殖及增强细胞毒性(图5)。

讨 论

T淋巴细胞在抗肿瘤免疫应答中发挥着重要的作用，以T细胞为主的过继性免疫细胞在肿瘤免疫治疗领域也越来越受到重视。虽然T细胞相关的过继性免疫治疗需要经过体外的扩增培养或基因工程化改造，但是主要分群仍然是CD4+和CD8+T细胞，两者相互协调共同发挥抗肿瘤功效[13-14]。幼稚CD4+T细胞可以根据特征性效应细胞因子和转录因子分化为不同辅助性T细胞(Th)，CD4+T细胞的持续性和记忆性是T细胞体内长时间抗肿瘤的关键[15]。CD8+T细胞是T细胞发挥肿瘤杀伤作用的主要细胞群，但是缺失CD4+T细胞的帮助会导致严重的CD8+T细胞耗竭[16]。因此，如果能够体外增强CD4+T细胞的功能，可能是提高过继免疫细胞疗效的关键。

本研究探索了5种不同剂量和5个不同时间点添加DAC对CD4+T细胞增殖的影响。实验结果显示，高剂量的DAC，尤其是超过200 nmol/L剂量时，在体外培养过程中会降低CD4+T细胞的增殖。在1 000 nmol/L时，T细胞会出现大量的死亡。在10 ～ 100 nmol/L剂量范围内，DAC能够促进CD4+T细胞的增殖。值得注意的是，无论是CD4+还是CD8+T细胞，来自中央记忆型T细胞亚群比效应记忆型T细胞亚群具有更加持续性的抗肿瘤能力[13,17-18]。本研究证实，DAC修饰的CD4+T细胞TCM表型以及TSCM表型显著增加。

图4 低剂量DAC对CD4+T细胞持续抑制肿瘤能力的影响Fig. 4 Effect of low-dose DAC on long-term tumor inhibition ability of CD4+ Tcells(n=3)

当T细胞处于耗竭状态时，其分泌的细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ等降低，从而降低了细胞的溶解及增殖能力[19]。本研究通过ELISA检测效应细胞和肿瘤细胞共培养后细胞因子的分泌结果提示，DAC组的IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-α较对照组显著增高。IL-2是促进T细胞增殖的关键细胞因子，而FasL、IFN-γ以及TNF-α则是T细胞发挥细胞毒作用的关键细胞因子。DAC不但能够促进细胞增殖相关的细胞因子分泌，同时还能够促进细胞毒相关的细胞因子分泌，与相关研究观察到DNA去甲基化能够增强体内IL-2及INF-γ分泌的结果相符[10,20-21]。在细胞因子分泌增多的同时，本研究观察到了DAC修饰的T细胞对肿瘤细胞杀伤作用的增强。CD8+T细胞是发挥抗肿瘤作用的主要作用细胞，CD4对与肿瘤细胞的杀伤作用很弱。但本研究观察到，在DAC处理后CD4的抗肿瘤能力有了明显的提高，虽然无法达到100%清除肿瘤细胞能力，但相对于未修饰CD4+T细胞，DAC修饰后的CD4+T细胞对肿瘤细胞发挥了长效抑制作用。

综上所述，本实验结果提示，低剂量DAC能够显著促进CD4+T细胞增殖和记忆表型，并提高持续抑制肿瘤细胞增长和分泌细胞因子的能力。在此研究基础上，我们将进一步通过动物实验验证DAC修饰的T细胞的抗肿瘤功效，进行基因组学水平分析探索DAC对CD4+T细胞关键转录因子以及信号通路等的影响。